[发明专利]TSH免疫测定以及用于在存在内源性污染物的情况下以有限洗涤形式进行TSH免疫测定的方法

说明书

相关申请的交叉参考

本发明要求2011年5月27日提交的美国临时申请号61/491,088(将其完整内容和公开内容通过引用并入本文)的优先权。

发明领域

本发明总地来说涉及在具有最小洗涤容量的系统中进行免疫测定的方法。特别地，本发明涉及在存在促甲状腺激素(TSH)的相关的污染性（交叉反应性）内分泌糖蛋白激素类似物的情况下进行促甲状腺激素(TSH)测定的方法。本发明还涉及选择具有用于进行TSH测定的最佳性能特性的抗体的方法。这些测定还受益于包含进一步减小干扰性物质例如内分泌糖蛋白激素类似物的作用的清除剂(scavenging reagents)。

发明背景

最早于1959年开发的免疫测定已成为用于人和兽医学健康以及环境测试的有用的灵敏诊断工具(Wu,2006,Clinica Chimica Acta,369:119)。其应用已是广泛的并且在本领域是熟知的。

存在几个进行免疫测定的方法，本发明聚焦在非竞争性或夹心免疫测定上。免疫测定还可被分类为非均相的或均相的。均相测定具有更简单的测定特征，但已被限定于高浓度药物(Engel & Khanna,1992,Journal of Immunological Methods,150:99)。非均相测定需要将结合的材料与未结合的材料分离并且是本发明的焦点。

夹心免疫测定通常作为两步测定来进行，所述测定包括首先将含抗原样品引入共价连接至固体支持物的捕获抗体。然后洗掉非特异性样品组分，留下结合至固体支持抗体的目标抗原。在第二步骤中，将检测或信号抗体引入测定，随后进行另一个洗涤步骤。最后，将检测底物添加至测定中来定量抗原浓度。具有相关洗涤步骤的两步骤免疫测定通常是优选的，因为它们减弱本底信号，从而允许高灵敏性检测。

“一步”夹心免疫测定可通过将检测抗体和含抗原样品一起引入共价连接至固体支持物的捕获抗体来进行。洗涤所得的测定以除去未结合的试剂。最后，将检测底物添加至测定以定量抗原浓度。

存在对具有有限洗涤液体积的一步测定的需要，因为它们更简单并且需要更少的步骤和更少的相关硬件复杂性来进行操作(特别是在护理现场应用中)。对于护理现场设备，减少或消除对洗涤步骤的需要减少了装置成本和测定时间、硬件成本和复杂度以及一次性装置的尺寸，这继而有益于减少环境中的废弃物以及其成本。

迄今为止，具有有限洗涤步骤或无洗涤步骤的一步免疫测定未曾用于抗原，其中内源相关抗原的存在产生混淆检测结果的高本底。当内源抗原以超过目标抗原的高摩尔浓度被发现(这对于一些疾病状况是常见的)时，这尤其如此。

有问题的抗原的实例是促甲状腺激素(TSH)，也称为促甲状腺素，其通常与相关的内分泌糖蛋白激素绒毛膜促性腺激素(CG)、促黄体激素(LH)和滤泡刺激激素(FSH)组合地存在。这4种相关激素具有相同的α亚基和高度相似的β亚基(Vassart,2004,Trends in Biochemical Sciences,29(3):119)。因此，抗α亚基的抗体不区分这4种激素(Wada,1982,Clinical Chemistry,28(9):1862)。也难以鉴定可区分所述4种相关激素的β-特异性抗体(特别是在极高浓度的污染性激素存在的情况下)，因为这些激素具有极相似的初级序列(Cornell,1973,The Journal of Biological Chemistry,248(12):4327)。此外，还难以鉴定TSH上的独特(抗原性)表位以及难以获得识别这些独特表位的抗体。对于夹心测定，还很重要的是：使用不重叠的捕获和信号抗体，所述抗体具有适当的特异性特征，这进一步限制了抗体的选择。

夹心免疫测定中的洗涤步骤帮助减少反应中的污染性激素的浓度，这减少了与污染性物质相关的信号。因此，不具有洗涤步骤或具有有限洗涤能力的一步夹心免疫测定一直以来在相关污染性激素分子存在的情况下，尤其当污染物以极高浓度存在时，不能特异性检测TSH。参见，例如，US20080311676,其描述了在免疫测定中使用洗涤步骤来减少交叉反应性物质的浓度的重要性。解决这些问题的努力可见于Hashida等人1986,Analytical Letters,19,1121-36;Soos等人,1984,Journal of Immunological Methods,73,237;和Lode等人,2003Clinical Biochemistry,36,121中。