[发明专利]重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法

权利要求书

1.重组蛋白质衍生物，其包含基因融合的重组生物活性蛋白质单体单元的同多聚体，所述单体单元通过合适的肽接头部分连接，其中蛋白质单体单元具有天然生物活性蛋白质的氨基酸序列或具有至少95％同一性的基本上相同的序列。

2.根据权利要求1的重组蛋白质衍生物，其中所述合适的接头部分具有选自以下的氨基酸序列：(S-G₄)_n-S，其中n＝2-7，和SGLEA-(EAAAK)_m-ALEA-(EAAAK)_m-ALEGS，其中m＝2-8。

3.根据权利要求2的重组蛋白质衍生物，其中所述合适的接头部分具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白质衍生物，其中所述同多聚体包含至少两个蛋白质单体单元的单链并且所述生物活性蛋白质单体单元选自：细胞因子、生长因子和激素，其中细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子或干扰素，优选粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或干扰素。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白质衍生物，其中所述生物活性蛋白质单体单元是重组干扰素α-2a，同多聚体是二聚体，优选具有氨基酸序列SEQ ID No：6。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白质衍生物，其中所述生物活性蛋白质单体单元是重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)。

7.粒细胞集落刺激因子的同多聚体，其包含至少两个通过如权利要求2或3中所定义的合适的接头部分连接的基因融合的重组粒细胞集落刺激因子蛋白质单体。

8.根据权利要求6或7的粒细胞集落刺激因子的同多聚体，其为粒细胞集落刺激因子的二聚体，具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10和SEQ ID No：11。

9.根据权利要求6或7的粒细胞集落刺激因子的同多聚体，其特征在于体内循环时间增加。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的粒细胞集落刺激因子的同多聚体，其用于治疗。

11.根据权利要求6至9中任一项所述的粒细胞集落刺激因子的同多聚体，其用于制造药物，所述药物用于治疗使用单体粒细胞集落刺激因子蛋白质的适应症中的疾病和病症。

12.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求6至9中任一项所述的粒细胞集落刺激因子的同多聚体，以及可药用载体、稀释剂、赋形剂和/或辅助物质。

13.制备根据权利要求5至8中任一项所述的粒细胞集落刺激因子的同多聚体的方法，其包括以下步骤：

a)在合适的培养基中在允许目的蛋白质表达的条件下培养生产者微生物，其宿主细胞包含编码目的基因融合蛋白质的核苷酸序列，

b)裂解所述生产者微生物并分离不溶性目的蛋白质级分，

c)使所述不溶性蛋白质级分溶解，

d)将所述目的蛋白质复性，

e)将目的蛋白质进行色谱纯化，

其特征在于

-所述不溶性蛋白质级分的溶解在含有尿素或盐酸胍作为离液剂的缓冲体系中进行，

-复性是在存在溶液中的氧化/还原谷胱甘肽对或金属离子、或者色谱载体上固定化金属离子的情况下目的蛋白从包涵体的氧化复性，以及

-通过色谱法的纯化是通过固定化金属离子亲和色谱进行的纯化，以及

-还通过至少一种离子交换和/或凝胶过滤色谱进行的另外纯化，或通过依次使用阴离子交换色谱和阳离子交换色谱的联合离子交换色谱而进行的另外纯化。