[发明专利]重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质生物技术领域，实际上，本发明提供了增加有治疗价值之重组蛋白质体内循环时间之难题的一个解决方案。更具体地，本发明涉及制备具有经延长循环半衰期之干扰素α-2a或粒细胞集落刺激因子的基因融合的同多聚体，所述多聚体包含至少两个通过限定长度的接头遗传连接的蛋白质单体单元，和有效地分离和纯化所产生的生物活性G-CSF二聚体。本发明还涉及用于在宿主细胞中表达的合成基因，所述合成基因编码含有在G-CSF单体单元之间限定长度之接头的人G-CSF二聚体形式。

背景技术

在本申请中，术语“有治疗价值的蛋白质”指适用于治疗并通过遗传工程产生的有药理活性的蛋白质，包括哺乳动物抗体、血液产品替代物、疫苗、激素、细胞因子。潜在的治疗性蛋白质与传统的新药物实体(其一般为低分子量的生物活性化合物)在许多重要方面不同。为了有效，蛋白质药物在与其天然形式显著不同的环境中以与其天然形式显著不同的浓度使用，并且这可导致体内不良反应。为了避免毒性或使其最小化并增加有效性，通常通过一些形式的蛋白质修饰(例如与其他大分子共价缀合、抗体结合、诱变和糖基化)来改变蛋白质的物理化学性质和生物学性质。

术语“生物活性蛋白质”指表现出与各自天然蛋白质相同的可检测生物活性的蛋白质分子。

术语“单体单元”指天然发生的生物活性之蛋白质的单一多肽链。

术语“同多聚体”指由多于一个的相同生物活性的多肽亚单位组成的线性多肽链，其通过肽接头分子以通过二硫键连接多肽亚单位以外的方式相互连接。

术语“基因融合”指使用如下重组DNA方法学获得同多聚体蛋白质：构建由两个或更多个通过接头DNA序列连接的单体蛋白质的基因(编码序列)组成的人工DNA片段，将所述DNA片段引入载体并在所选择的细胞类型中表达蛋白质。重组蛋白质由与接头肽序列相连的单体蛋白质(可在进行特定纯化过程后分离的蛋白质)组成，不同于通过使用特定化学方法连接两个或更多个单体蛋白质儿获得的“化学缀合”蛋白质以及通过单体蛋白质使用化学试剂或聚合物残基对单体蛋白质进行化学修饰而获得的“化学修饰”蛋白质。

在过去的二十五年中，生物化学、蛋白质化学和分子生物学的进展促使重组蛋白作为可注射治疗剂的使用增加和发展。自从1982年批准第一个重组产品胰岛素以来，蛋白质和肽生物药物已被成功地用作在治疗多种病生理状态中非常有效的药物。一组已被批准的第一代蛋白质生物药物模拟天然蛋白质并用作替代治疗，而另一组则呈递单克隆抗体用于将拮抗剂治疗或活化有功能故障的机体蛋白质[S.等，PEGylation of therapeutic proteins，Biotechnol.J.，5，113-128(2010)]。第一代生物药物的主要缺点为：其非最佳的物理化学、药代动力学和药效动力学(PK/PD)特性。主要限制为物理化学不稳定性、有限的溶解度、蛋白水解稳定性差、相对短的消除半衰期、免疫原性和毒性。因此，蛋白质治疗主要为肠胃外施用[S.等，Biotechnol.J.，5，113-128(2010)]。

在过去十年间，已经开发出了针对第二代生物药物发展的多种技术，包括通过赋予第一代蛋白质药物的主要产品以改进的PK/PD特征。体内循环半衰期的延长是这些治疗的主要目标。长效形式的促红细胞生成素(EPO，包含两个N连接的寡糖链，名称为Aranesp)粒细胞集落刺激因子(PEG化的G-CSF，名称为Neulasta)和干扰素(PEG化的IFNα-2b(名称为PEG-Intron)或PEG化的IFNα-2a(名称为Pegasys))是第二代生物药物的成功实例，其获得了“重磅炸弹”的地位。