[发明专利]一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法

权利要求书

1.一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，以此为模板通过PCR扩增获得TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，所用引物为：

TYCP1：5’-GCG GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’， 下划线为EcoRI酶切位点，

TYCP2：5’-GCG CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3’， 下划线为Xho I酶切位点；

（2）将TYLCV-CP基因片段与表达载体pET-32a连接，转化受体菌获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0.1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；

（3）以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时采血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24.3mg/mL的抗体IgG；

（4）用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP，其中 IgG浓度为0.822-1.145mg/mL；

（5）以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6.25μg/mL，酶标抗体稀释度为1:400；

IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min；

酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记时，将1mg纯化的IgG与800IU的碱性磷酸酶混匀，加PBS缓冲液到0.5mL；在其混合液中加入4μL 25%戊二醛，室温放置2h，每30min上下颠倒一次；4℃中用PBS缓冲液透析过夜，透析物转移至离心管中，加入5mg牛血清白蛋白，4℃保存备用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（2）纯化目的蛋白为使用蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP 纯化。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于抗血清纯化时使用抗体纯化柱：l mL的HiTrap Protein A 抗体纯化柱。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（2）中受体菌为E.coliBL21(DE3)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于底物溶液为将5mg对硝基苯磷酸二钠溶于7.5mL的含11.6%二乙醇胺的pH为9.8的底物缓冲液中。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于TYLCV-CP基因的PCR扩增反应体系为：2x Taq MasterMix 12.5 μL，10 pmol/L的 TYCP1  1.0 μL，10 pmol/L 的TYCP2  1.0 μL，模板DNA 1.0μL，加双蒸水至终体积25.0 μL；PCR反应条件为94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃继续延伸10min。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（2）中诱导表达步骤如下：将获得的阳性菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L和0.5mmol/L，37℃诱导表达4 h。