[发明专利]西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR-RFLP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点PCR-RFLP检测方法。

背景技术

家畜遗传缺陷多呈现隐性遗传模式的原因可能与家畜的生产方式不无关系，尤其是奶牛。人工授精(Artificial Insemination，AI)及精液低温冻存技术(Semen Cryopreservation Techniques)在奶牛生产繁育中的应用，为奶牛的人工授精育种体系(AI breeding system)的建立奠定了坚实基础。公牛因AI技术可承担更多母畜配种任务，因而可以被广泛应用于群体当中，获得大量后代，使得高产的基因在群体中迅速传播。精液低温保存技术使优秀种用公牛不受时间和地域限制，实现全球范围内遗传物质的交流(张沅，2001)。经严格遗传评定的验证公牛(Tested Bulls)在奶牛遗传改良中发挥巨大的推动作用。

人工授精技术的广泛应用使全世界种质资源交换日益频繁。对种公牛的高强度选择，使奶牛基因库缩小，群体平均近交系数大大增加。有研究表明，美国荷斯坦牛的群体近交系数以每年0.1％的速度持续增长，2004年出生的母牛平均群体近交系数高达5.0％(Hansen等，2005)。近交导致群体有效大小减小，一些不利基因的纯和，尤其是隐性基因控制的遗传缺陷，由于携带者表现正常，不易通过常规临床检测方法检出，致病基因“潜伏”在群体中很难被剔除。只有当群体中隐性突变基因频率达到一定程度时，临床阳性的个体大量出现，带来不利影响和经济损失。如荷斯坦牛的Weaver综合征(单雪松等，2006)、白细胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)(孙艺等，2006)、脊椎畸形综合征(Complex VertebralMalformation，CVM)(Chu等，2008)等。因而，寻找隐性缺陷病的致病突变，对致病突变建立准确快速的分子检测方法，注重对有害基因的识别与淘汰是奶牛育种工作的重要任务之一。

综上所述，动物遗传缺陷的致病基因研究是遗传学的重要组成部分。在家畜育种工作中，建立快速有效的动物遗传缺陷致病位点的分子检测方法，对种用动物、进口的遗传种质、甚至某些发病群体全群进行致病位点检测，对携带致病基因的个体进行标记或淘汰，降低遗传缺陷在动物群体中的传播与蔓延带来的经济损失。

自1975年，Rieck和Schade首次报道了德系西门塔尔牛群体中出现的一种新的犊牛先天畸形，并定名为牛蜘蛛腿综合征(AS)。Buitkamp等(2008)年报道了自2004年-2007年，绝迹三十多年的AS病例又在西门塔尔牛中重新出现，并且相继报道了大量的病例；系谱分析及后期测交试验证实了该病在德系西门塔尔牛群体中是属于常染色体单位点控制的隐性遗传缺陷。Buitkamp等(2009)将德系西门塔尔牛AS致病基因定位于BTA23。Buitkamp等(2011)年对AS的精细定位及群体检测证实MOCS1基因c.1224_1225delCA突变为西门塔尔牛AS的致病突变。但是，到目前为止，还没有一种适合商业操作的西门塔尔牛AS致病位点快速准确的检测方法。本发明需要解决的问题即根据目前的研究进展，设计一种快速准备，成本低廉的检测方法，以进行商业化试剂盒的生产。

商业化遗传病检测试剂盒的生产对我国的畜牧业蓬勃发展意义重大。随着中国奶牛杂交生产以及肉牛改良工作的开展，大量从国外，包括德国在内，引进西门塔尔优秀种公牛和公牛冻精，其中存在AS携带者。为了防患于未然，杜绝AS疾病给我国牛业带来不必要的损失，早发现、早淘汰是最好的途径。通过建立快速准确的携带者分子检测平台，完善我国牛遗传缺陷数据库，同时结合系谱分析，对引进西门塔尔牛以及现有群体中携带者的后代进行筛查，及时淘汰携带者，对我国奶业和肉牛业的发展都具有非常重要的意义。

PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法是在RFLP技术(Botstein等，1980)基础上结合PCR技术发展起来的。PCR-RFLP技术首先对目的片段进行PCR扩增，将PCR产物经限制性内切酶消化，致病等位基因产生与正常等位基因酶切产物不同长度片段，通过电泳区分基因型。