[发明专利]乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。

背景技术

乌苏里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)隶属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)蝰蛇科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)亚洲蝮属(Gloydius)，在我国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁(北部)、内蒙古(大兴安岭以东)，是我国东北分布广泛、种群数量最多、毒性强的一种毒蛇，具有重要的经济价值和药用价值。

蛇毒成分复杂，含有包括凝血酶、类凝血酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、精氨酸酯酶等在内的拥有多种生物活性的酶类。其中，在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白和纤维蛋白原的酶，称为纤维蛋白溶酶(fibrin(ogen)olytic enzyme，FLE)，简称纤溶酶。蛇毒纤溶酶具有降解纤维蛋白和纤维蛋白原的作用，能够通过抑制第VIII凝血因子影响正常凝血酶的生成。研究表明蛇毒纤溶酶具有明显的抗血栓作用，可用于心脑血栓和心肌梗塞的治疗，可作为一种潜在的强力抗栓剂，目前世界各国正在进行相关的研发工作。

发明内容

本发明提供一种乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，按以下步骤进行：

一、构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体ppFASTBACHTa-FLE重组质粒；二、ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取及纯化；三、重组质粒注射小鼠：取20μg纯化的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，用生理盐水稀释到小鼠体重的1/10，小鼠经尾静脉注射稀释的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，在5s内注射完毕，8h后，将小鼠经颈椎脱臼处死，取出肝脏组织，放入生理盐水中；四、真核表达产物的制备：采用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗小鼠肝脏组织3～5次，然后按照200mg组织/ml的比例向肝脏组织中加入单去污剂裂解液，匀浆，然后于4℃、12000r/min离心10min，取上清液，采用亲和层析法进行蛋白纯化，即完成乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备。

本发明提供了一个乌苏里蝮蛇毒FLE基因，其编码纤维蛋白溶酶FLE，具有纤溶活性，能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。可用于溶解在心肌梗塞、中风、血栓等期间形成的血凝块，作为一种强有力的抗栓、溶栓药物，将在心肌梗塞、中风、血栓等病症的治疗中发挥重要作用。

附图说明

图1为具体实施方式三中真核表达产物的SDS-PAGE电泳结果；图2为具体实施方式三中真核表达产物的Western blot检测结果；图3为具体实施方式三中对照组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果；图4为具体实施方式三中实验组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果；图5为具体实施方式三中真核表达产物的纤溶活性鉴定结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

具体实施方式二：本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

乌苏里蝮蛇毒FLE基因的获得方法如下：

一、乌苏里蝮蛇毒腺总RNA的分离