[发明专利]拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高种子寿命和萌发活力中的应用

说明书

技术领域

 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高种子寿命和萌发活力中的应用。

背景技术

种子作为农业生产的根本，其寿命和活力对于植物繁殖、作物产量、种质资源保存和生物多样性起着决定性的作用。成熟的干种子即使是在合适的贮藏条件下也会劣变，其程度随着贮藏时间的延长而加剧，并最终导致种子丧失活力，不能萌发。种子的劣变通常伴随着一系列生理生化上的变化，如DNA的损伤、脂质的过氧化和蛋白的损伤等。McDonald等认为，种子寿命受内在的遗传因子和外在的环境因素共同影响。尽管对于种子寿命和活力已经进行了大量的研究，但是对其确切的机理仍然不是十分清楚。农业生产上对种子质量的另外一个判断标准是种子在不利条件下的萌发活力，高质量的种子即使在逆境条件下仍能够保持高的萌发率和长出健壮的幼苗。

关于种子劣变的原理，人们普遍接受的是自由基氧化学说，其中活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）被认为是导致种子劣变的一个重要因子。ROS能够将DNA 、脂类和蛋白质过氧化，使得这三类生物大分子无法正常行使其在细胞中的功能，进而导致细胞的破裂和植物组织的损伤。为了应对由活性氧引起的氧化损伤，植物进化出了一套完整的抗氧化系统，包括酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统。抗氧化系统效率的高低通常影响着种子的寿命和活力。例如，2004年，Sattler等证明维生素E对于维持种子的寿命和活力起着至关重要的作用。2008年，Oge等发现L型异天冬氨酸甲基转移酶参与种子的寿命和萌发活力。而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶也被证明与种子的寿命和活力有关（Bailly 等，1996，2001；Lee 等，2010）。

DNA糖苷酶（OGG1）是一类能够将DNA中错配碱基切除的蛋白质，其参与碱基切除修复（base excision repair，BER）过程。已有的研究表明，OGG1与动物的多种疾病和衰老密切相关(Jaiswal et al., 2001; Osterod et al., 2001; Shinmura and Yokota, 2001)。在模式植物拟南芥中，AtOGG1在种子发育后期脱水阶段和种子萌发前期吸水阶段表达大量上调，表明其可能跟种子成熟和萌发有很大的关系。种子脱水和吸水的过程中伴随着大量的ROS产生，进而导致DNA损伤和种子的衰老，AtOGG1能够参与BER途径修复DNA，因此其与种子衰老也有着密切的关系。种子在逆境条件下萌发同样会导致大量的ROS产生，因此AtOGG1在种子萌发前期表达大量上调也与种子在不利条件下的萌发活力密切相关。

发明内容

本发明的目的在于提供拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1的新用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

研究发现，拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1具有提高种子寿命、萌发活力等功能，尤其是种子在胁迫环境如甲基紫精、高盐、甘露醇、高温等人工老化条件下的萌发活力。

本发明主要通过制备含有拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1的转基因植物种子实现提高种子萌发活力的目的。具体制备方法如下：

一种制备高萌发活力种子的方法，通过拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1的表达载体转化根癌农杆菌，转化的根癌农杆菌浸染植株后培养，收获的种子即为高萌发活力种子。

所述拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1的表达载体是由AtOGG1的编码基因插入到真核表达载体pBI121构建而成，具体制备方法如下：

（1）以拟南芥总RNA为模板，反转录得cDNA作为模板，以SEQ ID NO:1~2所示序列为引物，扩增AtOGG1基因；

（2）以扩增的AtOGG1基因为模板，以SEQ ID NO:3~4所示序列为引物，扩增含酶切位点的AtOGG1基因片段；

（3）将含酶切位点的AtOGG1基因片段与载体pGEMT-Easy进行连接，构建中间载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，培养后挑取单克隆测序鉴定，提取鉴定正确的克隆的质粒，用Sma I和Sac I进行双酶切，回收小片段，与同样经过Sma I和Sac I进行双酶切的pBI121载体连接，得到表达载体。