[发明专利]一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及药学领域，具体地说涉及一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用。

背景技术

中药注射液源自中医药经典验方，对治疗疾病起着重要的作用，并在临床上广泛应用，但是，中药注射液导致的过敏反应却制约了其进一步的发展。产生过敏反应的原因有：中药注射液成分复杂、质量不稳定、含有大分子物质如植物蛋白、鞣酸等以及大量半抗原成分。其中，大分子物质可以通过超滤以及分子筛等方法加以去除，但是中药注射液中的小分子半抗原除了少数已知的，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，还有很多未知的半抗原成分，目前还没有一种确切的方法加以分离和鉴定。

半抗原又叫做不完全抗原，在免疫学中指只有抗原性而无免疫原性的物质。半抗原分子量小，只有与体内的大分子物质如蛋白质等结合后才能形成完全抗原，常规分离抗原的方法难以分离半抗原。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，本发明的另一个目的是提供谷胱甘肽在分离中药注射液中半抗原的应用。

技术方案：对于利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，本发明是利用谷胱甘肽分离中药注射液中的半抗原，采用固定有谷胱甘肽S转移酶(GST)的层析柱来分离获得能与谷胱甘肽结合的半抗原成分。本发明利用半抗原的亲电子基团易同蛋白质的亲核基团反应这一特性，使半抗原与谷胱甘肽反应生成以共价键结合的复合物，再用能与谷胱甘肽特异性结合的GST将上述复合物从混合液中分离出来。

值得注意的是，本发明所述谷胱甘肽包括但不限于谷胱甘肽，所述谷胱甘肽还包括含有谷胱甘肽的多肽以及谷胱甘肽类似物，所述谷胱甘肽能和谷胱甘肽S转移酶发生酶-底物结合反应。

另外，本发明所述的混合液是包含若干种已知或未知半抗原以及其他成分的混合液。本发明所述半抗原是可与谷胱甘肽形成共价复合物的半抗原。利用本发明所述方法分离混合液中的半抗原都属于本发明的保护范围。

本发明主要包括如下步骤：

(1)制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱；

(2)将混合液与还原型谷胱甘肽溶液充分混匀，反复通过步骤(1)制得的亲和层析柱，用高浓度还原型谷胱甘肽溶液冲洗亲和层析柱洗，洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的谷胱甘肽-半抗原复合物；

(3)去除步骤(2)洗脱后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色谱法分离获得谷胱甘肽-半抗原复合物的各个单一组分。

所述步骤(1)中固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，其制备方法是：PCR扩增pGEX4T1质粒中的谷胱甘肽S转移酶DNA序列，将其连接到pET28a(+)质粒中，转化到感受态细菌，继续培养并筛选出能正确表达谷胱甘肽S转移酶的阳性克隆，继续培养使细菌大量繁殖，收集细菌，用超声破碎细菌，离心后取上清液通过镍层析柱，将谷胱甘肽S转移酶固定在层析柱上。

所述谷胱甘肽S转移酶是末端含有6个组氨酸的重组蛋白质。本发明是利用6个组氨酸能够与镍离子螯合的特性，将末端含有6个组氨酸的谷胱甘肽S转移酶固定在层析柱上。添加组氨酸标签对于重组蛋白质的分离与纯化十分有利，细菌自身蛋白质不包含连续的6个组氨酸序列，而该序列可以同镍离子形成牢固的螯合物，从而将重组表达的蛋白质固定在亲和层析柱上，这种结合可以被高浓度的咪唑破坏，方便将重组表达的蛋白质解离下来，而达到分离和纯化的目的。该方法步骤简单，可获得大量重组蛋白，并且纯度高，杂蛋白少。

有益效果：本发明的一种利用谷胱甘肽分离中药注射液中半抗原的方法可以迅速获得大量潜在的半抗原，方法简单易行，耗时短，可以有效节省时间和财力，还可为后续半抗原分析提供有力的技术支持。

具体实施方式

实施例1

1.制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，利用重组谷胱甘肽S转移酶的His-Tag连接到镍层析柱，制备成可以和谷胱甘肽进行特异性结合的GST亲和层析柱，具体步骤如下：

(1)按照商业化试剂盒(B型质粒小量快速提取试剂盒，北京博大泰克)的方法收集pGEX4T1质粒，用PCR方法扩增质粒中谷胱甘肽S转移酶DNA序列；

正向引物序列为GGAGGATCCGTATTCATGTCCCCTATACTAGGT，

反向引物序列为GGACTCGAGAACCAGATCCGATTTTGGAGGATGGT。