[发明专利]人白细胞介素-10的高效表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种由生物技术制备人白细胞介素-10(hIL-10)的方法，特别涉及一种毕赤酵母高效表达hIL-10的载体的构建方法和高效表达hIL-10菌株的筛选和建立。

背景技术

hIL-10能抑制T细胞介导的免疫炎症反应和通过刺激B淋巴细胞反应而参与体液免疫调节，具有良好的临床应用前景。目前已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。天然hIL-10主要由巨噬细胞产生的分子量为18.5KD，无糖基修饰，活性形式是由非共价键连接两个单体而形成的同源寡二聚体。

国内外对hIL-10作用机制及临床治疗疾病的应用进行了广泛而深入的研究，一方面确认了hIL-10生物学功能，另一方面也扩展了其临床应用范围；因此，市场对hIL-10的需要将越来愈大。目前国内外已报道hIL-10的重组表达系统主要有Ecoli，CHO-K1，还有一些研究人员使用植物叶片表达；使用酵母表达hIL-10的相关工作也很少，关键是难以大量得到具有天然活性的同源寡二聚体。国际市场上重组hIL-10非常昂贵，且国内尚无企业生产。国际上商品化重组hIL-10主要是大肠杆菌来源的，具有161个氨基酸，比正常hIL-10多一个氨基酸，在治疗上具有潜在的危害。而大肠杆菌主要以包涵体的形式表达hIL-10，是无生物学活性的蛋白复合物，且变复性过程复杂，回收率低，严重影响了hIL-10的研究和应用。

本发明前，一些研究人员用invitrogen公司购买的常用毕赤酵母表达载体，如pPIC9K(刘立藏，马辉文等.人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达.武汉大学学报，2004，50(2)和井申荣，邹全明等.重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(9))，pPICZαA(陈富超，孙万邦等.重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定.中国免疫学杂志，2011，27(8))等，转化毕赤酵母表达菌株(如GS115，X-33等)，参照invitrogen公司推荐的毕赤酵母表达菌株的常规筛选方法。由于这些常规的的毕赤酵母表达载体获得高拷贝菌株的几率很低，而用pAO815载体(井申荣，邹全明等.白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达.中国生物制品学杂志，2007，20(2))的方法虽然也能获得高拷贝菌株，但这种方法十分费时费力，且结果不佳和不容易实现。同时，常规的筛选高效表达菌株是在温度为28-30℃下进行的，忽略了酵母分泌机制可能对重组蛋白表达的不利影响，导致外源表达蛋白在细胞内储留并造成酵母细胞生存力影响。因此，利用常规的筛选方法未能获得hIL-10的高效表达菌株。

发明内容

1.本发明的技术方案

本发明一方面提供一种适用于酵母高效表达外源重组蛋白的方法，以及用于该方法的表达载体的构建方法。

本发明另一方面提供一种hIL-10的酵母表达方法，以及用于所述方法的载体的构建方法。

具体而言，本发明一方面提供用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤：

1)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；

2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；

3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所表达的外源蛋白优选地是人白细胞介素-10。

在本发明这一方面，利用rDNA在毕赤酵母基因组中的多拷贝特性，设计以rDNA的非编码区为整合位点，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，从而有利于获得外源基因的高效表达；同时，发明人发现，通过逐步增加抗生素的浓度，扩增所述表达载体的拷贝数，然后构建含有不同拷贝数的克隆的库，在此基础上选择表达克隆，可以容易地获得高拷贝菌株，进而表达和回收外源蛋白。

优选地，发明人发现选择分散在酵母的4条染色体上的rDNA非编码区，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，有利于获得外源基因的高效表达。

更优选地，发明人发现使用序列为SEQ ID No：1的rDNA非编码区有利于高效地将外源基因的多个表达载体同时转入到一个克隆中，并且转化得到的高拷贝克隆稳定性好，可以容易地获得高效表达的菌株。

在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括低温下甲醇诱导外源蛋白分泌表达。