[发明专利]SCX/HIC双功能混合模式色谱固定相及其制备方法

权利要求书

1.结构式（I）所示的疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相， 

其中X为-OCH₃或-OCH₂CH₃;

R为，其中n=1~5；或，其中n=1~6；或PEG200-1000。

2.权利要求1所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，包括以下步骤：

（1）胱氨酸与硅烷偶联剂反应后加入硅胶反应得胱氨酸键合硅胶衍生物；

（2）将胱氨酸键合硅胶衍生物与DDT反应得半胱氨酸键合硅胶衍生物；

（3）将半胱氨酸键合硅胶衍生物与浓硫酸反应得到磺酸基键合硅胶衍生物；

（4）将磺酸基键合硅胶衍生物与脂肪族醇、芳香族醇或PEG，以及DIC、DMAP反应得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

3.根据权利要求2所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取1份重量的胱氨酸溶于碱性缓冲溶液中，调节pH至11.0，冰浴搅拌下，加入0.5～1份重量的硅烷偶联剂，冰浴搅拌反应30 min，然后升温至60～80℃反应12～24小时，反应完毕，用冰醋酸调反应液pH至4.0～7.0，加入0.5～1份重量的硅胶，80～95℃下反应1.5～4小时，过滤、洗涤、干燥，即可得到胱氨酸键合硅胶衍生物；

（2）将1份重量的胱氨酸键合硅胶衍生物分散于pH为7～8的缓冲溶液中，加入0.1～0.4份重量的DDT，室温搅拌反应1～3小时，过滤、洗涤、干燥即可得到半胱氨酸键合硅胶衍生物；

（3）将半胱氨酸键合硅胶衍生物分散于甲醇和25～35%的H₂O₂的混合溶液中，搅拌下滴入浓硫酸，使反应液呈弱酸性，在20～35℃下反应10～24小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得到磺酸基键合硅胶衍生物；

（4）将1份重量的磺酸基键合硅胶衍生物分散于有机溶剂中，加入1.5～3份重量的脂肪族醇、芳香族醇或PEG，1.5～3份重量的DIC，0.1～0.3份重量的DMAP，室温搅拌24～48小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

4.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（1）所述碱性缓冲溶液为0.5mol/L的Na₂CO₃缓冲溶液，每克胱氨酸所需缓冲溶液的量为50～70mL。

5.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（1）所述硅烷偶联剂结构如下：

 

其中X为-OCH₃或-OCH₂CH₃。

6.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（1）中所用的硅胶为全多孔硅胶小球，粒径为3～40μm，孔径为50～300?，且经过1:1盐酸活化3～7小时，然后洗至中性，100～160℃真空干燥10～24小时。

7.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（2）中所用缓冲溶液为1mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，每克胱氨酸键合硅胶衍生物所需缓冲溶液的量为10～20mL。

8.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（3）中的氧化反应以甲醇与25～35%的H₂O₂体积比1:2～5的混合溶液再加入浓硫酸使之呈弱酸性为反应介质，每克半胱氨酸键合硅胶衍生物所需反应液体积为30～40mL。

9.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于：步骤（4）中所用有机溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺，每克磺酸基键合硅胶衍生物所需有机溶剂的量为25～40mL。

10.权利要求1所述的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在蛋白分离纯化中的应用。