[发明专利]SCX/HIC双功能混合模式色谱固定相及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相，具体地说是一种疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，本发明还涉及该混合模式固定相的制备方法和用途。

背景技术

随着生物技术和生命科学的发展，无论重组蛋白质药物的生产还是蛋白质组学的研究都依赖于蛋白质的高效快速的分离技术。复杂样品的分析对分离科学提出了越来越高的要求，而发展新型高效分离材料、分离模式和高灵敏度的检测方法是解决该问题的有效途径之一。

多维液相色谱(MDLC)是蛋白质组学等复杂样品分离分析的关键技术。通常的一根色谱柱只能利用一种分离模式对生物大分子进行分离纯化，如反相(RPLC)、疏水(HIC)、离子交换(IEC)和亲合(AFC)等。所以目前二维液相色谱(2DLC)的构建就需要两根作用力性质完全不同的色谱柱。“混合模式色谱”(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的[姚善泾等，化工学报，2007，58: 2169-2177；Zhao G F, et al.,J Biotech, 2009,144 :3–11; Mc Laughlin, et al., Chem Rev, 1989, 89：309-319]。混合保留机理的分离介质可提供两种以上的作用力用于溶质的分离。与单一色谱分离模式相比，MMC具有更高的选择性和吸附量。一些学者采用溴化氰法把脂肪胺和芳香胺交联在琼脂糖上, 合成疏水相互作用固定相。由于配体上带有胺基，使这种疏水固定相具有一定的离子交换性质，因此认为蛋白质的分离是静电相互作用和疏水相互作用的共同结果。1986年，Regnier小组首次合成了阴离子交换/疏水色谱混合模式的阴离子交换固定相[Kennedy L A, et al,J Chromatogr A, 1986, 359: 73-84] ;随后Horvath小组报道了同样的结果[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469: 3-27]。虽然现在MMC有反相和离子交换混合模式[Apfelthaler E, et al, J Chromatogr. A, 2008, 1191: 171-181]、反相和亲水混合模式[Liu X, et al. J Chromatogr. A, 2008, 1191: 83-89]、亲水和离子交换混合模式[Strege M A, et al., Anal Chem, 2000, 72: 4629-4633]等类型，但MMC仍以一种作用力为主，另一种力为辅，所以混合保留机理的色谱填料都是以一种分离模式为主的，即一种分离模式的分离较好，而另一种分离差，不能有效地用于蛋白质样品的二维分离，因此不能称之为二维色谱填料。

虽然混合模式色谱柱已商品化，如GE公司的Capto MMC和Capto adhere，Pall公司的HEA，PPA和MEP色谱柱等，均是以离子交换为主，疏水作用为辅。所以，迄今为止, 尚未发现任何一种混合色谱填料可以分别用两种完全不同的功能（如IEC和HIC）对蛋白质进行二维液相分离，而且都能得到以某种单一分离模式进行分离时达到的分离效果。2009年发明人研究小组合成出了一种同时具有疏水和弱阳离子交换双功能基团的新型高效色谱分离介质[柯从玉等，科学通报，2008，53：614 ~ 616；Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009, 1216: 3553-3562]。在高盐浓度下表现为疏水色谱的性质，可作为疏水色谱分离介质使用；而在低盐浓度条件下表现为离子交换色谱的性质，可作为离子交换色谱分离介质使用，并深入研究了在疏水和离子交换两种模式下蛋白质的混合保留机理[Liu P, et al., J Chromatogr. A, 2009, 1216: 7497–7504]。与相应的单机理色谱填料相比，表现出独特的选择性，在一定程度上提高了分离能力。在此基础上，利用阀切换技术，采用一根具有WCX-HIC的二维色谱柱构建了在线二维液相色谱分离系统，称之为单柱-二维液相色谱分离新技术[Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009, 1216: 3553-3562]。