[发明专利]鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法。

背景技术：

蛇皮果(Salacca zalacca)是一种果形独特、果肉富含钙铁、果实采摘方便、适合我国海南和云南栽培的热带果树。有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而蛇皮果是雌雄异株植物，有性繁殖生产的实生苗肉眼难以鉴定其性别。性别不明的实生苗造林后容易造成雌株分布不均、修复成本高和单产低等后果。传统肉眼鉴定蛇皮果植株性别需要等待植株开始繁殖生长，而蛇皮果植株初次繁殖生长时间的年龄在海南和云南为3年。2009年印尼有报道称可利用同工酶来鉴定蛇皮果实生苗的性别，但该技术的具体步骤和过程资料难以取到，因此国内生产上还不能对蛇皮果实生苗性别进行鉴别，实生苗造林的后果还是难以避免。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用以鉴别蛇皮果雌雄性别的DNA片段、引物和方法。

本发明运用RAPD方法在雄性蛇皮果基因组中扩增出一条雄性蛇皮果所特有的特异性条带，通过克隆和测序获得一段长度为1638bp的DNA片段，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA片段可以用以鉴别蛇皮果的雌雄性别。本发明人根据该特异性的DNA片段设计了一对蛇皮果雌雄性别鉴定引物：

LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，序列如SEQ ID NO.2所示；

LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′，序列如SEQ ID NO.3所示。

根据该对蛇皮果雌雄性别鉴定引物能够扩增出一条雄性蛇皮果拥有的特异性序列，其长度为1579bp。

本发明的蛇皮果性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：常规提取蛇皮果样品的基因组DNA，以其作为模板，以LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′作为引物进行PCR反应，将PCR产物进行电泳检测，电泳结果中出现一段1579bp条带的样品为雄株，而相同部位没有出现条带的样品为雌株。

所述的PCR反应优选为：PCR反应体系为15μL，反应液中含10×buffer 1.5μL、dNTPs 0.12mmol/L、Taq DNA聚合酶0.10U/μL、MgCl₂ 1.4mmol/L、引物LF4和引物LR4各0.3μmol/L、12ng蛇皮果基因组DNA模板；反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃30秒、39℃30秒、72℃2分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。

本发明提供的如SEQ ID NO.1所示的DNA序列为雄性蛇皮果所特有的特异性DNA序列，可以用于鉴定蛇皮果的雌雄性别。实验结果表明，本发明的鉴定引物和鉴定方法能够准确的鉴别出蛇皮果的雌雄性别，相比于传统肉眼鉴定蛇皮果植株性别需要等待植株开始繁殖生长才能鉴定，本发明具有简单，方便，随时都可以鉴定的优点，为更有效、合理的种植蛇皮果创造了条件。

附图说明：

图1是实施例1的RAPD产物的电泳图，其中1～10为雌性蛇皮果实生苗，11～20为雄性蛇皮果实生苗；

图2是实施例2的PCR产物的电泳图，其中1～10为雌性蛇皮果实生苗，11～20为雄性蛇皮果实生苗。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

以已确定性别的雌雄蛇皮果各10株作为样品，按照下述方法提取基因组DNA，进行RAPD扩增和电泳。

步骤1：叶片采集

以蛇皮果实生苗直立未展叶为第1叶，往下数第3叶的叶片作为采集叶，在该叶上取5厘米×5厘米的叶片，拭去叶样表面灰尘和水分，并放至塑料袋里，然后将塑料袋密封并放至冰袋。

步骤2：基因组DNA提取