[发明专利]总胆汁酸的定量测定及测定试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及总胆汁酸(TBA)的定量测定方法、试剂及试剂盒。

背景技术

胆汁酸是在肝脏从胆固醇生成的24-碳类固醇化合物，在人体液中的胆汁酸主要有五种形式：胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、和熊脱氧胆酸。这些胆酸合起来称为总胆汁酸(TBA)。血清胆汁酸水平是反映肝实质损伤的一个重要指标。餐后TBA测定对检出轻度肝脏病变的灵敏度优于所有其他肝功能试验。对检测酒精或工业化学品引起的肝细胞损伤的灵敏度优于其它肝功能试验。

大多数胆汁酸测定方法在测定前需有分离提取步骤，这是因为胆汁酸的不溶性、多型性和以多种结合状态存在于体液中等因素。常用的分离方法包括采用有机溶剂和中性树脂提取，阴离子交换层析方法等，但这些方法都有较多的缺陷，如不易将所有各种不同形式的胆汁酸同时全部提取与分离，实验费时，操作繁琐，而且无法进行自动化测定因而不适合在临床实验室应用。而且由于一般情况下血清中的胆汁酸含量较低，上述方法重复性与准确性也往往达不到要求。

胆汁酸作为从胆固醇转化形成的类固醇，其分子上3α-羟基对3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)的酶催化作用比较敏感，胆汁酸C3上α位的羟基在3α-HSD的作用下脱氢形成羰基，此酶促反应的辅酶是氧化型辅酶I(NAD⁺)，反应后NAD⁺作为受氢体转化成还原型辅酶I(NADH)。根据这一酶法反应的原理发展出几种可以适合临床实验室进行胆汁酸分析的方法，其一是直接检测NAD⁺向NADH的转变，但因血清样品中胆汁酸的含量较低而不易准确测定；其二是在上述单一酶促反应基础上增加另一电子受体如刃天青，刃天青接受NADH的递氢作用后可被激发出荧光，但此法需要特殊的荧光分光光度计且不能进行自动分析；其三是在上述单一酶促反应基础上增加另一个酶(黄递酶)和另一个受氢体(硝基四氮唑蓝NBT)，NBT受氢后生成有色物质，可以用比色法测定，但也存在检测灵敏度与准确性的问题，且因需要用磷酸或盐酸中止反应，所以也难以自动化分析；虽然后来对上述第三种方法作了改进后也发展出可以进行自动分析的方法，但由于血清中总胆汁酸(TBA)的浓度较低，而且血清中存在的干扰物质对测定结果的影响相对较大，例如一个主要的干扰因素是血清中存在的乳酸脱氢酶(LDH)，由于LDH催化的反应生成的NADH往往比TBA生成的量要大得多，对测定结果有明显的正干扰，导致测定结果偏高。血清样品中存在的其他脱氢酶和还原性物质也会产生正干扰，同样导致测定结果偏高。

后来发展了测定TBA的第五代循环酶法。此法的反应体系中引入辅酶I的一种硫代衍生物，也有氧化型和还原型，即氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)和还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。所谓循环酶法，其反应过程的原理如下：

胆汁酸被3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)氧化，生成3-酮类固醇，脱下的氢被Thio-NAD接受，使Thio-NAD转化为Thio-NADH；同时在反应体系中还存在NADH时，3α-HSD又催化逆向反应，使正反应生成的3-酮类固醇又氧化成为胆汁酸，完成一个循环。经如此反复循环的酶反应，Thio-NADH的生成量不断增大，在一定时间内，酶循环产生的β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)量与样品中胆汁酸浓度成正比。Thio-NADH在395nm～415nm波长处有光吸收峰，可在自动生化分析仪器内连续监测410nm的吸光度变化，求得胆汁酸的浓度。

目前，以第五代酶循环法测定TBA的市售试剂多为进口产品，价格偏高。经相关专利的检索，未检索到第五代酶循环法测定TBA的试剂(盒)的专利。因此，研制发明适用于自动分析的以第五代酶循环法测定TBA的方法，和性能更为优良，能有效抗干扰能力，价格更为低廉的试剂是值得所属领域技术人员努力的目标。

发明内容

在对酶循环法测定TBA的方法进行多年研究以及反复实验后，在以下几方面有了重大突破：

试剂中Thio-NAD、NADH来源的选择非常重要，对循环酶反应的效率、速度、和稳定性有直接影响。

1、试剂中Thio-NAD、NADH的浓度与相对比例的选择直接影响酶反应的速度，是准确测定样品TBA浓度的一个关键因素。

2、为使血清中各种胆汁酸(包括一级、二级和三级胆汁酸)都能通过循环酶反应而测定，在试剂中除了加入3α-羟类固醇脱氢酶之外，还加入了7α-羟类固醇脱氢酶。