[发明专利]一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法。

背景技术

全国组织培养室超过1000个，组织培养技术广泛用于农作物、果树、蔬菜、林木、观赏植物及中药材等近400种经济植物，在快繁和脱毒等方面取得了巨大的社会经济效益。因成本过高，组织培养的商业利用受极大限制，无法符合市场对高质量组培苗、低价位成本的需求。因此，降低成本是组培技术更成功商品化的首要条件。

在降低组织培养的培养基成本方面，多采用增加繁殖系数的方法，但繁殖系数的增加导致组培苗质量的降低，不但玻璃苗的比例显著提高，而且严重影响其后续的生长。琼脂是目前各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂，不仅用量巨大且是所有药品中最贵的一种，占药品成本的70%以上。仅组培级琼脂的市场价就高达160元/kg以上，常用的成本每升就高达8元以上。

淀粉是植物体中贮存的养分，是食物的重要组成部分，水稻中含淀粉62%~86%，但普通水稻品种的淀粉凝固抗性很低，胶体结构不稳定，难以直接或改性利用。直链淀粉在水中加热糊化后，不稳定且会迅速老化而逐步形成凝胶体，但这种凝胶体较硬，需高温才反向转化；支链淀粉在水溶液中稳定，凝胶柔软，且凝胶其强度随温度变化是可逆的。淀粉分支酶基因sbeIIb是调控淀粉合成的关键酶，可以优化促进直链淀粉的合成，实现直链淀粉及其凝胶特性的显著改良。

发明内容

正是在上述背景下，本发明的目的是提供一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，选用低直链淀粉含量籼稻为基础，通过淀粉分支酶基因优化促进直链淀粉的合成，获得淀粉凝胶性能兼顾直链与支链双重特性的水稻，创制高凝抗性且胶体结构稳定的新型淀粉基质，替代琼脂，发展新型生物培养生物基质，

广泛用于科研、医学和化工。

本发明的淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，包括以下步骤：

1）取直链淀粉含量介于10%~15%的水稻品种的成熟胚为外植体，接种至

诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；

 2）将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；

 3）将成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；

4）将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃、避光的黑暗条件下共培养2天；

5）将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；

6）取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指包括目的基因淀粉分支酶基因sbeIIb、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因淀粉分支酶基因sbeIIb片段长643bp；

7）取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，鉴定淀粉凝胶性能，选留淀粉糊化冷却后可形成半固态凝胶的转基因植株；

8）继续种植步骤7）筛选的转基因株系，评价的淀粉凝抗性表达稳定性，对淀粉凝抗性稳定的优良株系进行种子繁殖，为培育的淀粉基质专用水稻。

本发明中，所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1mg、NAA0.5mg、KT0.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。