[发明专利]基因重组VPAC2受体特异激动剂DBAYL及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，其特征在于：编码所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计并合成DBAYL基因：

采用3条引物两步法合成DBAYL基因：

引物F1：

5’-GGTGGTCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3’；

引物F2：

5’-CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’；

引物F3：

5’-CCACCAATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3’；

其中，GGTGGT或CCACCA为保护碱基，为NdeI酶切位点，为SapI酶切位点；

首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以F1和F3为引物，PCR反应制得DBAYL基因；

(2)构建重组载体pKY-DBAYL：

用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pKYB和步骤(1)制得的DBAYL基因进行双酶切，再将双酶切后的DBAYL基因和双酶切后的质粒pKYB连接，得到重组载体pKY-DBAYL；

(3)制备表达工程菌pKY-DBAYL/ER2566：

用重组载体pKY-DBAYL转化表达宿主菌大肠杆菌E coli Strain ER2566，得到表达工程菌pKY-DBAYL/ER2566；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pKY-DBAYL/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有硫醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；硫醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯；接着洗脱几丁质柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，从而产生稳定的水解产物；

③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL。

4.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的链延伸反应的条件为94℃10min；降至58℃5min；72℃10min。

5.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的PCR反应的条件为：95℃5min；95℃1min、55℃1min、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于：步骤(4)②中所述含有硫醇的溶液的组成如下：20mMTris-HCI，0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0；

步骤(4)②中所述反应的条件为25℃反应24小时；

步骤(4)②中所述洗脱几丁质柱的溶液的组成如下：20mM Tris-HCl，500mMNaCI，1mM EDTA，pH 8.0。

7.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于：步骤(4)③中所述利用高效液相色谱技术纯化目的多肽DBAYL的步骤如下：

A、流动相A为在体积百分比5％乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的终浓度为体积百分比0.1％；流速1mL/min，25min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由体积百分比0～60％，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。

8.权利要求1或2所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的应用，其特征在于：所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL用于制备治疗如下疾病的药物：糖尿病及其并发症，高血糖症，高血压，血栓症，肥胖症、心血管疾病、神经系统疾病、心脏及肾衰竭。