[发明专利]基因重组VPAC2受体特异激动剂DBAYL及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL及其制备方法，与其用于制备治疗VPAC2型受体相关疾病的药物，如：促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机体对高浓度血糖的应急能力，有效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加β细胞数量和抑制β细胞凋亡及调节免疫系统功能等作用。

背景技术

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是1990年被发现由脑垂体分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP有两种存在形式：PACAP38，由38个氨基酸组成；PACAP27，由PACAP38氮端的27个氨基酸组成。PACAP通过激活其特异的G蛋白偶联受体，提高靶细胞cAMP等第二信使的浓度，从而发挥广泛而重要的生物学功能。PACAP有三类G蛋白偶联受体：PAC1、VPAC1和VPAC2；三类受体在生物体中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受体分布于胰岛等组织，与能量代谢密切相关，从临床观点看，作为VPAC2型受体特异激动剂的特定PACAP衍生物可有效地降低血液葡萄糖水平，保护β-细胞功能及阻止疾病发展的潜力，且无低血糖症风险，可用于糖尿病的任何病期，作为具有广泛作用的神经多肽，对于二期和三期糖尿病患者具有优于其他药物的综合治疗作用，为公认的治疗Ⅱ型糖尿病的新型药物。

PACAP与VPAC2受体作用主要与腺苷酸环化酶(AC)藕联：通过cAMP信号传导通路，激活AC，催化ATP转化为cAMP，cAMP随之激活其依赖性蛋白激酶A(PKA)，PKA可使细胞内多种蛋白质磷酸化，产生生理效应，尤其是在促进相关基因转录有重要作用。PACAP通过VPAC2受体介导的生物学功能主要有：神经递质/调质、促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；调节能量代谢平衡等。

研究表明，VPAC2型受体特异激动剂可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机体对高浓度血糖的应急能力有效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加β细胞数量和抑制β细胞凋亡。但PACAP及其许多衍生物，如BAY55-9837等，在体内很快被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)降解；而且由于自身结构中含有影响其液体环境中稳定性的氨基酸组成，许多药物肽在生物体内稳定性较差。因此，研发生理环境下新型高稳定性VPAC2受体特异激动剂是PACAP及其衍生多肽用于Ⅱ型糖尿病治疗及临床应用急待解决的问题，研发作为VPAC2型受体特异激动剂的高稳定性PACAP衍生多肽，具有重要的药用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有更高稳定性和更高生物活性的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL。

本发明的另一目的在于提供所述基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法。该制备方法根据PACAP衍生多肽DBAYL的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计DBAYL在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽DBAYL的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。

本发明的再一目的在于提供所述基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，其氨基酸序列如下所示：

MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY；

编码所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的苷酸序列为：

ATGCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAACAGCTGGCGGCGAAAAAATATCTGCAGAGCATTAAACAGAAACGTTAT；

所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成DBAYL基因：

采用3条引物两步法合成DBAYL基因：

引物F1：

5’-GGTGGTCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3’；

引物F2：

5’-CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’；

引物F3：