[发明专利]一种检测利玛原甲藻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体为检测利玛原甲藻的方法。

背景技术

现阶段，我国对有害藻类的认识多侧重在浮游藻类，而对底栖藻类的研究工作还处于起始阶段，这就使得在过去的近岸海域生态调查时对底栖藻类鲜有记录。但是，随着我国有毒有害赤潮频发，使得水产品品质受到损害，食品安全问题成为人们首要关心的问题。由于便于培养及所分泌的毒素易制作成标准品，产毒底栖甲藻利玛原甲藻成为研究人员研究产毒藻类的重点内容。

利玛原甲藻常附生于大型海藻、海草、底层沉积物表面，以及珊瑚礁或红树林区域的浮砂碎石上，有着不同于浮游藻类的生态习性。它呈世界性分布，在我国南海海域也有报道。王朝晖等曾于1997年秋至1998年春对广东沿海多次赤潮进行研究时，在珠海附近的米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)赤潮发生区域的底层水样中检测出大量利玛原甲藻，浓度约为800Cells/L。利玛原甲藻能够产生包括OA(Okadaic Acid)和DTX-1(Dinophysistoxin-1)等在内的多种腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)。腹泻性贝类毒素一般以贝类作为载体，被滤食后在贝类体内富集，再通过食物链传递被人类或动物吸收，直接威胁到人类及动物的健康，甚至生命。相关实验证实，它能致使肠黏膜损伤，在一定程度上促进肿瘤并发。腹泻性贝类毒素同西加鱼毒(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)、神经毒性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)等一样，属于聚酮类化合物。这类化合物结构复杂，构型变化较多，主要由聚酮合酶(Polyketide Synthetase，PKS)催化形成。研究发现聚酮合酶以三种基本类型出现，而第一类型(Type Ⅰ)为多功能酶，由单一蛋白基团及其周围功能区域构成，是目前研究最为深入的类型。但它是否存在于甲藻中还有争议，但依据对聚酮合酶基因的研究来看，其在一些产DSP毒素的甲藻中被陆续发现，并证实在甲藻体外共生菌体内不存在。本发明是在此基础上，筛选利玛原甲藻中存在的聚酮合酶基因，克隆及测序后，设计特异引物及探针，并连同针对其rDNA ITS(ITS1-5.8S rRNA-ITS2)序列设计的特异引物和探针，初步建立双TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法检测利玛原甲藻。TaqMan探针实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比存在许多优势，它无需借助凝胶电泳或银染获取检测结果，可直接通过光电传导系统探测PCR扩增过程中荧光信号的变化得以知晓检测结果；而且，它较双链DNA内嵌染料(如SYBR green)定量PCR技术无法区分特异性和非特异性产物而言，TaqMan探针具有很高的特异性、信噪比，且可以进行多重检测。正是因为以上特点，它已被研究人员用于部分有害藻类的检测中。本发明也是借助该技术，期望以此可以提高对产毒底栖甲藻的实际检测效率和精度，有助于进一步实施在海洋环境中的检测，也为建立早期赤潮预警机制提供必要支持。

发明内容

本发明旨在提供一种检测利玛原甲藻的方法，实现定量检测。

技术方案为：针对利玛原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列设计特异性引物和TaqMan探针，利用实时(real-time)PCR方法荧光定量检测。

一种检测利玛原甲藻的方法，步骤包括：

(1)用CTAB改良法提取待测水样中的利玛原甲藻的基因组DNA；

(2)用特异性引物和特异性探针，扩增利玛原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一种，采用荧光定量PCR检测方法，对照标准曲线，确定待测水样中玛原甲藻含量；

rDNA ITS基因序列的特异性引物为：上游cttggaatggcgcaacaagc，下游aaaccacaagacacgatgaaacg；即SEQ ID No.1和No.2；

PKS基因序列的特异性引物为：上游atccccagcaacgattattaatgg，下游tgcgtgaaagcgaagagtcc；即SEQ ID No.3和No.4；

rDNA ITS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列：

ccaaacctgccaccgttcctcgct；即SEQ ID No.5；

PKS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列：

cggctcgctccaacgcttcccaac；即SEQ ID No.6。