[发明专利]一种猪瘟疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0, 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5604。

2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列SP和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通过BamH I/ EcoR I和XhoI/Hind III双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建表面展示系统转移载体pFastBacI-gp64；

(b)采用pvL1393-E2-2A-E0重组质粒为模板，以SEQ ID: NO.6和SEQ ID: NO.7为引物进行PCR扩增，构建融合基因E2-2A-E0；

(c)将步骤(b)所得的融合基因E2-2A-E0双酶切产物克隆至步骤(a)所得表面展示系统转移载体pFastBacI-gp64上，并筛选阳性克隆，获得转移重组质粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0；

(d)将步骤(c)所得转移重组质粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，培养16-20h后菌液稀释10⁶重新涂板做筛选，挑取白斑至LB培养基摇菌培养16-20h后，用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；

(e) 取步骤(d)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得零代病毒悬液0-4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0。

3.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0表达的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID: NO.11所示。

4.一种权利要求3所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将权利要求3所述的重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(b)以穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫、蛹；

(c)收集表达的权利3所述蛋白。

5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0在猪瘟疫苗制备中的应用。

6.一种权利要求3所述蛋白在猪瘟疫苗制备中的应用。