[发明专利]一种猪瘟疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟疫苗及其制备方法，尤其涉及猪瘟疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。 

背景技术

猪瘟（hog cholera, HC)又称古典猪瘟（classical swine fever, CSF），是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，死亡率高达90%以上。1984年世界动物卫生组织（OIE）将其列入A类传染病，也是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。 

1908年匈牙利HutyraK-oves制成猪瘟高免血清后，人们一直用高免血清—血毒同时肌注来免疫猪群。但由于高免血清价格昂贵，获取困难，加之血毒有散毒的危险，因此各国学者在以后的60年间相继研制出许多灭活疫苗，其中福尔马林和结晶紫灭活疫苗曾被广泛应用。灭活疫苗虽然安全，但是保存期短。 

1955年，周泰冲等人将CSFV石门强毒株经兔体214次传代后成功制备出兔化弱毒株。继续传代480次，成为商品化的标准疫苗株。后来被命名为中国疫苗株（C-strain）或猪瘟兔化弱毒（HCLV）株，很多商品化的疫苗株都由其衍生而来。1957年以来广泛用于世界许多国家，是目前世界上使用最广泛的弱毒苗，对控制CSF流行起到了关键作用。相比其它商品化的疫苗，它的安全性更高，菌毒在猪体内持续存在不超过3周，且不会引起仔猪和怀孕母猪发病；免疫效果更好，免疫一次就能产生完全的保护，保护时间长达一年甚至终生。常规弱毒疫苗尽管安全有效，但存在免疫抗体与感染抗体不能区分的问题，不能通过血清学方法来检测一个免疫猪群中的野毒感染，这对于猪瘟的防制与净化非常不利，也正因为这个原因，采取猪瘟免疫政策国家的猪及其制品的出口受到严格限制，这就使得开发能用血清学方法区分免疫猪与感染猪的新型疫苗成为当务之急。 

亚单位疫苗是一类能通过血清学方法方便的区分免疫动物与感染动物的疫苗。目前已有2种亚单位疫苗在欧盟获得了注册，这2种疫苗均是以杆状病毒表达的CSFV E2蛋白作为免疫原。但这种疫苗也存在一些缺陷，试验表明E2蛋白亚单位疫苗在免疫14d后才能产生对野毒感染的保护；同时，如果免疫时机体内有低水平母源抗体存在，至少要免疫两次才可诱导临床保护，即使如此，大多数已经产生临床保护的猪在攻毒时仍会有发热、白细胞减少和病毒血症的情况出现。另外，E2蛋白亚单位疫苗能否预防水平传播和垂直传播也有待证实。 

重组活载体疫苗是最先开始研究的标记疫苗，活载体疫苗能引起体液免疫和细胞免疫，且能在体内复制，能诱导长期和高效的免疫保护。用于猪瘟标记疫苗的病毒载体有痘病毒、伪狂犬病病毒（PRV）、猪腺病毒(PAV)等。但是它们都有明显的缺陷：重组痘苗病毒可能对未接种过痘苗的人具有潜在的感染性；重组痘苗病毒传播到环境中可能与野生型痘苗病毒发生重组，出现毒力返强现象；痘苗病毒对猪的感染性较低，必须注射高剂量的重组痘苗病毒才能诱导有效的保护；基于PRV载体疫苗不适用于伪狂犬病流行地区，因为PRV抗体对于免疫及血清学检测有一定影响；而 rPAV-E2和rPRV-E2虽然高效而且安全，但是没有得到具体的疫苗试验或者田间实验证实。 

DNA疫苗具备很多优势，发展非常迅速，但也存在潜在的安全隐患，如质粒DNA是否会整合到宿主基因组中、是否会引起免疫耐受等问题尚不清楚，且存在一定的安全隐患，此外DNA疫苗免疫效力尚有待进一步提高。 

基于以上各种情况，研究新型、有效的猪瘟疫苗已为研究者的努力方向，而且E2、E0蛋白是猪瘟病毒的主要抗原位点，是猪瘟疫苗研制的主要靶点。 

杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新的真核展示系统，可弥补原核展示系统的不足，并保持表面展示系统的优点，通过筛选表达特异蛋白的重组杆状病毒粒子即便于外源蛋白的纯化，可用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白，在高亲和力抗体及多肽药物的筛选、蛋白质抗原表位分析等方面具有广阔的应用前景。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种克服上述缺陷的猪瘟疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将猪瘟病毒的主要抗原基因E2、E0融合展示在家蚕杆状病毒囊膜表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为猪瘟疫苗原进行生产，相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。 

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：