[发明专利]高纯茶黄素复合物的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种高纯茶黄素复合物的制备方法。

背景技术：

茶黄素是指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质，由茶多酚(主要是儿茶素类及其衍生物)在多酚氧化酶存在下氧化缩合而来。红茶中茶黄素的含量约为0.5％～2.0％，但茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种与人体健康有关的潜在功效，如抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌、降血糖、降血脂、防治心血管疾病等，在某些功能方面甚至优于儿茶素。茶黄素是第一次从茶叶中找到具有确切药理作用的化合物；经过临床试验，验证了茶黄素具有调节血脂、预防心血管疾病的功效，而且无毒副作用。红茶茶黄素类物质的研究与开发不仅具有重要的理论价值，而且在天然药物、保健品、化妆品和日化用品等领域具有广阔的产业化前景。但是，茶黄素的化学研究不能满足医药领域研究的要求，如茶黄素的提纯难度较大、性质欠稳定等限制了药用研究的深入。所以，到目前为止，茶黄素提制的产业化工艺技术尚不成熟，表现为产品纯度低、成本高、产能低，严重阻碍了以茶黄素为原料的天然药物及功能性食品的研究与开发。由于红茶中茶黄素的含量低，依靠红茶为原料来提制茶黄素成本过高，必须研究如何采用儿茶素为原料，筛选特异多酚氧化酶酶源，利用生物技术酶促氧化合成茶黄素，采用柱色谱制备高纯茶黄素，具有重要的理论与实际意义。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种系统、安全、低成本的高纯茶黄素复合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种高纯茶黄素复合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

A、按1g绿茶儿茶素混合物加75～100ml多酚氧化酶粗酶液的比例，将绿茶儿茶素混合物加入多酚氧化酶粗酶液中，通入氧气，以气泡不溢出反应容器为宜，搅拌，20～40℃恒温水浴反应20～40min，立即用等体积的预冷至-18～-20℃的乙酸乙酯萃取，酯层在40～45℃真空浓缩，回收乙酸乙酯，干燥，得茶黄素粗品；

B、按1g茶黄素粗品加10～15ml 20％体积浓度的乙醇水溶液的比例，将上述茶黄素粗品用乙醇水溶液溶解，将溶解液以0.6～0.8BV/h的流速通过装有吸附树脂的层析柱至吸附饱和，先用2～3BV 20％体积浓度的乙醇水溶液以0.8～1.0BV/h的流速洗脱，再用2～3BV 60％体积浓度的丙酮或乙醇水溶液以0.8～1.0BV/h的流速洗脱，收集60％体积浓度的丙酮或乙醇水溶液洗脱液，将洗脱液在40～45℃真空浓缩，回收丙酮或乙醇，冷冻干燥，得高纯茶黄素复合物；

上述提及的乙酸乙酯、乙醇和丙酮皆为分析纯。

上述绿茶儿茶素混合物为EGC和EC含量高的儿茶素混合物或小叶儿茶素混合物。儿茶素混合物中EGC＞20％，EC＞9％，EGCG＞10％；小叶儿茶素混合物中EGC＞10％，ECG＞9％，EGCG＞40％。

上述多酚氧化酶粗酶液是取于-18～-20℃冷冻的梨果实去皮切碎，然后用预冷至-18～-20℃、pH 5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行匀浆提取多酚氧化酶，过滤离心，上清液即为多酚氧化酶粗酶液；酶液置于0～4℃环境中待用，提取时，梨果实与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的比例为1g∶1～2ml。

上述吸附树脂为30～60目的聚酰胺粉或NKA大孔吸附树脂。

与现有技术相比，本发明的优点是：本发明方法工艺简单、成本低，生产过程中避免使用有毒有害的有机试剂，保护环境；并且通过控制不同的反应条件可以获得不同茶黄素组成的高纯茶黄素复合物，产品得率高，含量高。

附图说明：

图1是本发明实施例1的HPLC图谱。

其中：峰1为茶黄素；峰2为茶黄素-3-没食子酸脂；峰3为茶黄素-3’-没食子酸脂；峰4为茶黄素-3，3’-没食子酸脂。

具体实施方式：

本发明中用到的仪器设备和参数：

高效液相色谱仪：日本岛津公司Shimadzu LC-10ATVP系统控制器，LC-10ATVP二元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器以及Shimadzu LC-Solution色谱工作站；

色谱分析时的参数：色谱柱为ODSC18(4.6mm i.d.×150mm，5μm)，流动相A为2％醋酸，流动相B为乙腈-乙酸乙酯(体积比21∶3)，梯度洗脱，流动相B在30min内从18％线性梯度变化到30％，流速0.9mL/min；柱温40℃；检测波长280nm；进样量10μl。

旋转蒸发仪：瑞士步琪公司Buchi R200；