[发明专利]用于多重连接扩增技术的探针制备方法

权利要求书

1.用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤：

1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1（5’端带荧光基团修饰）和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RPO-N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；

2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LPO-N’，其中GPL是由GP1的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO-N’由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；

3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

4）纯化回收PCR产物；

5）采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA；

6）采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。

2.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤2）所述的用于扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。

3.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤3）所述PCR扩增得到的5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行Lambda外切酶消化。

4.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤5）所述的Lambda外切酶消化过程中，1μg双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。