[发明专利]用于多重连接扩增技术的探针制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体为可用于多重连接扩增技术（MLPA）的长探针的制备方法。

背景技术

多重连接扩增技术(multiplex 1igation-dependent probe amplification，MLPA)是一种高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。

至今MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，并且不断的有新的技术改进，尤其是在探针设计上，有采用M13单链噬菌体插入到衍生的序列两端涉及了限制性内切酶识别位点，以便获得采用双酶切获得长探针；

在申请号为200910108977.4，名称为“可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法”，文件中公开了一种采用PCR方法结合亲和素磁殊法制备可用于多重连接扩增技术的长探针，该公开的技术方法主要包括：针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物；通用引物的5’端标记生物素；以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；将生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁蛛相互吸附；使生物素标记的的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；离心取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。该方法虽然操作简单，但是需要磁珠分离系统，成本较高，并且在磁珠分离过程中有磁珠结合不完全造成dsDNA残留，探针得率不高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种低成本、高得率的可用于多重连接扩增技术的探针制备方法。

用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤：

1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1和GP2，用于最后的PCR扩增检测，所述的GP1为5’端带荧光基团修饰，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RPO-N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；

2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LPO-N’，其中GPL是由GP1的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO-N’由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；

3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

4）纯化回收PCR产物；

5）采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA；

6）采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。

扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。

所述PCR扩增得到的5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行Lambda外切酶消化。

步骤5）所述的Lambda外切酶消化过程中，1μg双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。

本发明所述MLPA探针制备方法与采用M13噬菌体制备MLPA相比，具有以下优点：

1）PCR扩增引物简单，只需考虑引物Tm值和长度等一般性问题，通过结合目标核苷酸序列，针对模版设计一对引物即可。

2）利用简单的PCR和Lambda外切酶消化即可获得长探针，无需M13噬菌体培养，可一天内完成探针制备工作，大大降低了MLPA技术门槛。

3）无需进行克隆制备，无需特异性内切酶酶切，操作简单。

4）探针制备灵活性更强，可针对基因组DNA、质粒、人工基因序列等进行制备所需探针。

5）探针所需的填充序列来源方便，可使不同探针填充序列保持一致，也可根据需要选择不同模版扩增所需填充序列，降低杂交时的非特异性杂交，提高检测成功率。

本发明所述MLPA探针制备方法与采用链亲和素磁珠法制备MLPA相比，具有以下优点：

1）成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，无需添置单独的磁珠分离系统，且每μgDNA探针制备成本不到磁珠法1/10。