[发明专利]转Bt基因棉花标准质粒及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种转Bt基因棉花标准质粒，及其在定性检测转Bt基因农作物及定量检测转Bt基因棉花转基因含量上的应用，以及利用该标准质粒对转Bt基因农作物的转基因含量进行检测的荧光定量PCR检测试剂盒。

(二)背景技术

Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)晶体蛋白基因的简称。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt二大类。迄今为止，已经报道的Bt达到476种，其中Cry分为58群、449种，Cyt分为2群、27种(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html)。经过密码子优化的Bt基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。

目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中水稻、玉米、棉花、马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用产业快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到2010年的14800万公顷，14年间增长了87倍。

ACP基因是棉花内源基因，用于定量检测的棉花ACP基因片段长度为116bp的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有棉花品种中含有ACP基因；还具备种间特异性，即在除棉花外其它物种里没有该基因DNA片段。

近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。

质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒分子在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种转Bt基因棉花标准质粒，解决转基因Bt农作物尤其是转Bt基因棉花检测中标准物质缺乏的难题，提供一种准确、快速、简便的转基因Bt农作物尤其是转基因棉花检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接后，加入常见的酶切位点，插入常规克隆载体(如pEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T等)制得。

具体的，所述的转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.3插入pEASY-T3载体制的，以下简称308号质粒。所述SEQ ID No.3由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接，加入酶切位点Pst I、Nde I及Sal I(该酶切位点位于两片段间)得到。

所述308号质粒由如下方法构建：

1.设计PCR特异性引物；

2.PCR扩增；

3.Bt目标序列获取，片段长度174bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；