[发明专利]一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是由动物细胞合成的一类蛋白质家族，胶原蛋白由三条肽链组成，肽链自身为左手螺旋结构，三条α肽链则以平行右手螺旋形式缠绕成三股螺旋结构而构成胶原蛋白分子。胶原蛋白可根据多肽的氨基酸序列差异及其交联方式分为多种类型，现在已经发现30余种不同类型的胶原蛋白。不同类型的胶原蛋白显示出高度的歧异性，包括大小、序列、组织分布和分子组成等，各类型胶原蛋白在理化性质、组织分布和合成机制以及在胚胎期、成年期的结构与功能上存在一定差异。目前，胶原蛋白多肽开发的重点集中于采用化学法、酶法及其耦合实现胶原蛋白制备工艺及不同分子量范围的胶原多肽分离分级，所分离组分区分度和特征性均存在不足。

胶原蛋白在体内具有重要的生物学功能，含有多种生物活性肽。Byuu HG和KIM SK等人首先利用碱性蛋白酶、链酶蛋白酶E和胶原酶共同水解鱼胶原蛋白，进而利用凝胶过滤、离子交换和反相层析分离到两种具有抑制血管紧张素转化酶活性的三肽Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met [Process Biochemistry, 2001,36:1155-1162]，他们采用同样的方法水解牛胶原蛋白，得到了具有类似活性的三肽Gly-Pro-Val [Journal of Agriculture Food Chemistry,2001,49: 2992-2997]。XY Gao等人以酶解明胶为原料，采用纤维连接蛋白亲和色谱法-凝胶过滤和反相层析法，分离得到具有抗肿瘤活性的12肽和15肽，此两肽位于胶原蛋白的非三螺旋核心区[European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1998, 45: 275-284]。Maruyama S等人从猪胶原蛋白嗜热菌蛋白酶水解液中分离的Gly-Pro-Arg是一种纤维蛋白原/凝血酶凝集抑制剂[Biochimica et Biophysica Acta,1993,1164:215-223]。

RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸–天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)序列的多肽，RGD肽是细胞发生特异性识别的结构基础之一，RGD肽在肿瘤治疗、抗血栓、治疗急性肾衰等方面均具有一定效果和应用价值。目前RGD肽的制备方式主要有三种：（1）从天然动植物体内提取；（2）化学法合成；（3）重组DNA技术制备。第一种方法针对性强，但RGD肽在生物体内含量极低，大规模制备受限；第二种对结构特殊、或天然不存在的RGD肽制备具有优势，但该方法成本高，且副产物多；第三种方法应用广泛，但多适用于制备长肽和蛋白质，对RGD小肽制备不具备成本优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，步骤如下：

（1）将胶原蛋白溶于水，调节pH值为7.0~9.0；

（2）酶解：在胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，或者不会完全破坏胶原蛋白中RGD序列的酶，如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，加入量为胶原蛋白质量的1/5000~5/100， 30~45℃条件下酶解，酶解时间为1~8小时，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法测定酶解液吸光度，当吸光度不再增长时视为酶解完成，升高温度到55~65℃保温10~30分钟使胰蛋白酶失活，终止反应，得到胶原蛋白酶解液；

（3）过滤：在15~60℃温度范围内，采用截留分子量为3,000~20,000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到胶原蛋白多肽溶液；

（4）将胶原蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥，所得粉末即为胶原蛋白RGD活性多肽。

上述制备方法，其中步骤（2）所述胶原蛋白为动物源未降解的完整胶原蛋白，或者经过酸法、碱法、酶法处理过的胶原蛋白，或直接采用明胶。动物源的胶原蛋白原料可以是人、猪、牛、马、驴和鱼的皮、骨等来源的胶原蛋白。如果采用的胶原蛋白原料直接是水溶液的形式，则可以省去溶于水的步骤，直接调节pH值为7.0~9.0即可。

步骤（2）酶解优选加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活为1,000-5,000 U/mg，使用该比活的酶，能够在高效酶解胶原蛋白的前提下节省用量，降低生产成本。

步骤（3）滤膜截留分子量优选为5,000道尔顿，适合于小分子RGD活性肽的筛选。