[发明专利]一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用，此种DNA疫苗可直接用于动物试验。

背景技术：

血吸虫病(schistosomiasis)是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人畜共患寄生虫病。全球每年死于血吸虫病的人数超过2万。在我国流行的是日本血吸虫病。日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)致病的主要原因是雌虫所产的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中，形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化，肝纤维化可进一步导致门脉高压综合症如食管胃底静脉曲张、肝脾肿大和脾功能亢进，患者可因并发上消化道出血、肝性昏迷及结肠息肉癌变等严重病症而致死。

目前，血吸虫病疫苗的研究绝大多数集中在抗感染等预防性疫苗的研究上，而针对已经感染者，治疗性疫苗的研究则极少见。血吸虫感染人体后，雌虫产出虫卵为未成熟虫卵，部分沉积于肝脏，经过初产期、空泡期、胚胎期发育至成熟虫卵约需11日，虽然临床上可以使用高效的抗虫药吡喹酮杀虫治疗，但吡喹酮只能杀灭3d以上的童虫、成虫，而肝脏内的未成熟虫卵仍可继续发育，并引起组织内虫卵肉芽肿反应，目前血吸虫性肝纤维化研究的重点在于对已经形成的纤维化的治疗，尚无针对吡喹酮杀虫后由未成熟虫卵引起的肉芽肿反应的治疗方法。且血吸虫病患者发现时多已转为慢性，体内早已形成肉芽肿或肝纤维化，杀虫后病人依然有晚期转化的可能，虫卵等抗原的免疫病理反应并不因杀虫治疗而终止。因此，在血吸虫病患者杀虫化疗后，如何有效应对那些已经沉积在肝内的虫卵尤其是未成熟虫卵所产生的免疫病理反应而导致的肝纤维化的进一步发展则成为当务之急。

现已证实，细胞免疫和体液免疫均参与日本血吸虫病性肝纤维化的发生、发展，并以细胞免疫为主。肝纤维化的主要病理改变为血吸虫卵抗原的持续刺激引起TH₂型反应持续存在，导致肝星状细胞异常激活转化为肌成纤维细胞并大量增殖，产生的细胞外基质(ECM)超过了机体的降解能力，致使ECM在肝内过量沉积。在肝肉芽肿、纤维化形成过程中，TH₁/TH₂极化及其免疫调节起到非常重要的作用。现已普遍认为TH₁类细胞因子可以抑制肝星状细胞的增殖和胶原蛋白的合成。TH₁类细胞因子中与抗纤维化作用相关主要有：IFN-γ、IL-12、IL-18。IL-18又名IFN-γ诱导因子，能强烈诱导NK细胞、T细胞产生IFN-γ。Feng Wei等将含小鼠IL-18的质粒pVAX/IL-18与含日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(SjFABP)的质粒pVAX/SjFABP、含日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26GST)的质粒pVAX/Sj26GST联合免疫小鼠。结果发现，联合注射pVAX/IL-18组均显著增加了IFN-γ和IL-2产物，指示着IL-18能加强Th-1优势性免疫反应。Zhang等将IL-18基因修饰的肝细胞经脾移植入感染日本血吸虫尾蚴的小鼠后，发现IL-2、IFN-γ的表达水平明显升高，而IL-4、IL-10表达水平却显著降低，形成典型的Th₁型免疫应答。感染20周后，检测发现羟脯氨酸等表达水平降低，肝脏I、III型前胶原、羟脯氨酸及胶原含量明显降低，说明IL-18可诱导日本血吸虫感染慢性期从促进肉芽肿、肝纤维化形成的Th₂型免疫应答转化为抗纤维化的Th₁型应答优势，提示通过IL-18调控Th₁/Th₂极化的方向可减轻虫卵肉芽肿和肝纤维化的反应强度，以达到干预治疗肝纤维化的目的。

目前抗纤维化治疗着力于消除和抑制炎症的发生发展，尚无有效治疗能明显改善或逆转纤维化相关的炎症进程。TH₁细胞因子能直接抑制成纤维细胞的胶原合成，说明TH₁细胞因子是一种潜在的抗纤维化治疗靶点，其中能明显改善感染肝脏纤维化且已应用于临床的TH₁细胞因子有IFN-γ。然而传统的细胞因子免疫治疗是将利用生物工程技术生产的细胞因子注入患者体内，通过血液循环到达免疫原局部而起作用，这种治疗必需连续、大剂量用药，这势必导致毒副作用增加及宿主体内细胞因子严重失衡。因此，理想的治疗方法是即能有效的利用此类细胞因子进行抗肝纤维化治疗，同时又能将其导致的毒副作用和其它部位正常组织的细胞因子失衡减至最低。