[发明专利]人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法

权利要求书

1.人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）目的基因hBD-3的扩增；

（2）双酶切hBD-3基因与载体pPIC9k，连接构建重组载体，转化宿主菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）；

（3）筛选后的转化子再用甲醇诱导培养，离心所得上清液中即为人β防御素3。

2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述甲醇诱导培养是挑取转化子接种于50 mL BMGY液体培养基，30℃、200 r/min振荡培养18h至OD₆₀₀为2～6，5000 r/min离心5 min收集菌体，菌体用灭菌水水洗两次，将菌体用BMMY液体培养基重悬至OD₆₀₀值为0.8～1.2，每24h补加甲醇至终浓度为0.5%v/v，28℃，200r/min连续诱导培养5天。

3.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述BMGY液体培养基为1%wt酵母提取物，2%wt蛋白胨，1.34%wtYNB，0.0004‰wt生物素，100 mM pH 6.0磷酸盐缓冲液，1%wt甘油。

4.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述转化宿主菌前先将重组质粒用Sac I酶进行线性化。

5.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述目的基因hBD-3的获取方法是：

设计上游引物为：5’-ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3’，

下游引物为：5’-TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3’；以含hBD-3序列的T载体为模板，PCR扩增出末端带有EcoR I和Not I酶切位点的目的基因， PCR扩增条件如下：94℃变性2 min进入循环，94℃变性30 S，68℃退火50 S，72℃延伸1 min，35个循环后于72℃继续延伸10 min。

6.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述双酶切所用限制性内切酶为EcoR I和Not I。

7.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所用的宿主为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。