[发明专利]人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法

说明书

技术领域

 本发明公开了一种人β-防御素3的表达方法，特别是指一种在酵母菌表达系统中表达人β-防御素3的方法。

背景技术

防御素是抗菌肽家庭中最大的亚家族，是生物体内产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成部分，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统。截止目前研究发现防御素的种类有：哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素；而根据二硫键的位置，连接上的差异以及前体和表达方式不同，防御素又分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3类。

人β-防御素3（human β-defensin-3，hBD-3）是2001年Harder等在银屑病患者皮损组织中发现的防御素β家族抑菌活性最高的肽。hBD-3是由45个氨基酸组成的小分子多肽，相对分子质量为5154.7，由1个α螺旋和3个反向平行的β折叠片层组成，同时有一个短螺旋环在氨基末端区域形成。hBD-3由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，其连接方式为2～4、1～5、3～6。3个反向平行的β折叠片层通过17～19、27～31、39～43残基形成。hBD-3是两亲结构，包括疏水端和亲水端，疏水端聚集在肽表面的底部，正电荷在它的表面两端是不对称分布的。

相较于其他β防御素而言，人β-防御素3的功能性更广：（一）显著的抗细菌、抗真菌及抗病毒的活性，且抑菌浓度比已经观察到的防御素家族的其他成员更低；（二）在连接先天和获得性免疫应答中起到重要的桥梁作用；（三）诱导专职抗原递呈细胞产生和活化，有望成为疫苗佐剂；（四）其抗菌活性是非盐离子浓度敏感性的，不易引起溶血。在滥用抗菌药物，细菌耐药性问题日益严重的今天，人β-防御素3因具有高效杀菌、不易产生耐药性突变、无毒、适用性广、性能稳定等优点，有望代替传统的抗生素，开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒和抗癌的药物，应用开发前景广阔。

但是，要将人β-防御素3真正应用于生产实践，必须首先建立成本低廉、高效稳定的制备工艺，解决工业批量化生产问题。目前，防御素主要通过以下3种途径获得：（1）诱导生物体分泌表达后分离纯化；（2）化学合成；（3）构建防御素基因工程菌株。但天然存在的防御素产量很低，无法从动植物体内大量提取，且分离纯化具有抗菌活性的组成无疑是一件非常繁琐的工作；而化学合成防御素也存在成本高，大批量生产困难的弱点，因此，前2种方法无法满足防御素工业化生产的需求。相较而言，以工程菌工业化发酵生产防御素，可大规模生产，其生产周期短、生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境影响，因而探索适当的防御素诱导途径成为该领域研究的焦点。有许多实验对不同来源的防御素进行了重组表达尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统等。

自基因工程等生物技术发展以来，国内外学者对借助于基因工程菌制备人β-防御素3展开了广泛的研究，包括基因的获取、使用受体菌偏好基因人工合成基因、表达载体的构建、以及采用融合蛋白策略实验人β-防御素3在大肠杆菌的高效表达。黄蓬亮（黄蓬亮, 赵亚华, 许少鹏. 人β防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定. 生命科学研究, 2005, 9(2): 129-133）等根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用偏好合成了人β-防御素3，在大肠杆菌中诱导表达成功。李春丽等（李春丽, 何国庆, 崔淑贞. 人β防御素3基因的合成及其克隆. 河南农业大学学报, 2005, 39(3): 282-285）根据已知人β-防御素3的成熟区氨基酸序列和酵母密码子的偏好，人工合成人β-防御素3基因，并成功构建真核表达载体pPIC9k-hBD-3。庹晓晔等（庹晓晔, 徐明达, 陈璧, 等. 人β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析[J]. 军事医学科学院院刊, 2004, 28(2): 114–122）构建了人β-防御素3基因真核表达载体并在大肠杆菌中表达成功。李春丽等（李春丽, 徐雪丽, 郑振宇, 等. 人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表达菌的诱导条件优化及其活性分析. 生物工程学报, 2008, 24(3): 485-490）对人β-防御素3和植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG诱导表达条件进行了研究，经优化目的蛋白表达量占总蛋白的35%左右。何国庆等（何国庆, 李春丽, 阮晖等. 人β防御素3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达. 农业生物技术学报, 2005, 13(2): 217-220）嵌合人β-防御素3与植物甜蛋白Brazzein基因，在大肠杆菌中诱导表达后，目的蛋白约占总蛋白的30%。