[发明专利]EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

权利要求书

1.EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EF1α基因；二、将EF1α基因与pMD18-T载体连接，得到质粒pT-EF1α；三、分别对质粒pT-EF1α和pFB-VSVGED-WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EF1α和酶切后的pFB-VSVGED-WPRE连接，得到质粒pWK；四、以pAAV-LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L-ITR基因，分别对L-ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L-ITR和pWK连接，连接产物即为pWK-L-ITR；五、以pAAV-LacZ为模板，Ra和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R-ITR基因，分别对R-ITR基因和pWK-L-ITR进行单酶切，将酶切后的R-ITR和pWK-L-ITR连接，连接产物即为pWK-ITR；六、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-f和pEGFP-r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和pWK-ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK-ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5’-TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC-3’，引物WK3序列为5’-CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA-3’；步骤四中PCR扩增所用引物La序列为5’-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3’，引物Lb序列为5’-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3’；步骤五中PCR扩增所用引物Ra序列为5’-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3’，引物Rb序列为5’-ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3’；步骤六中PCR扩增所用引物pEGFP-f序列为5’-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3’，引物pEGFP-r序列为5’-TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。

2.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.2min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤四中PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸0.2min，共20个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤五中PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸0.2min，共20个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

5.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤六中PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。