[发明专利]EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

背景技术

随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基因治疗载体受到人们的高度重视，但现存的杆状病毒介导的外源基因表达量与工业化大生产的要求有较大差距。并且持续表达的时间较短，转导效率低等，这些因素都限制了杆状病毒表达系统的应用。因此，杆状病毒表达系统的研究的重点就在于将外源基因表达时间延长，表达效率、转导效率提高。从而为改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

发明内容

本发明是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题，提供EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

本发明EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EF1α基因；二、将EF1α基因与pMD18-T载体连接，得到质粒pT-EF1α；三、分别对质粒pT-EF1α和pFB-VSVGED-WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EF1α和酶切后的pFB-VSVGED-WPRE连接，得到质粒pWK；四、以pAAV-LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L-ITR基因，分别对L-ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L-ITR和pWK连接，连接产物即为pWK-L-ITR；五、以pAAV-LacZ为模板，Ra和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R-ITR基因，分别对R-ITR基因和pWK-L-ITR进行单酶切，将酶切后的R-ITR和pWK-L-ITR连接，连接产物即为pWK-ITR；六、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-f和pEGFP-r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和pWK-ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK-ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5’-TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC-3’，引物WK3序列为5’-CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA-3’；步骤四中PCR扩增所用引物La序列为5’-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3’，引物Lb序列为5’-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3’；步骤五中PCR扩增所用引物Ra序列为5’-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3’，引物Rb序列为5’-ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3’；步骤六中PCR扩增所用引物pEGFP-f序列为5’-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3’，引物pEGFP-r序列为5’-TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。

本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，成功构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP，WPRE增强了外源基因的表达效率，VSV-GED增强了病毒的转导效率，ITR延长了表达时间。

附图说明

图1为重组杆状病毒BV-pWK(-)-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况；图2为图1相应的细胞核染色的OL细胞；图3为重组杆状病毒BV-pWK-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况；图4为图3相应的细胞核染色的OL细胞；图5为重组杆状病毒BV-pWK-ITR-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况；图6为图5相应的细胞核染色的OL细胞；图7为peglk质粒图谱；图8为pFB-VSVGED-WPRE质粒图谱；图9为pAAV-LacZ质粒图谱；图10为pEGFP-C3质粒图谱。

具体实施方式