[发明专利]使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法和核酸链固定化载体

说明书

本申请是中国专利申请200680046297.9的分案申请，原申请的申请日是2006年12月8日，发明名称是“使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法和核酸链固定化载体”。 

技术领域

本发明涉及用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的核酸引物序列、试剂盒、和核酸链固定化载体，并涉及通过使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法。 

背景技术

在1980年代，据报道人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起子宫颈癌的原因，并且特别引人注意的是癌恶性度和HPV基因型之间的关系。也认为HPV是引起非子宫颈癌的其它癌的原因，其中所述其它癌如生殖器癌和口腔粘膜癌，因此需要快速且正确地检测HPV的方法。至今为止，已知通过使用DNA/RNA识别抗体检测恶性或良性基因型的方法、以及通过聚合酶链反应(PCR)扩增包含对于基因型而言特征性序列的区域并最后通过使用基因型特异的探针鉴定基因型的方法。但是不能鉴定基因型的前一方法不能应用至当前开发的用于疫苗施用的检测。另外，使用PCR法的后一方法也有缺点，如核酸提取等预处理的繁锁操作、需要复杂的温度调节设备如热循环仪、和较长的两小时或更长的反应期间。此外，PCR法有这样一种可能性，如果偶然合成了不正确的互补链，该产物可用作扩增中的模板，结果导致不正确的判断。实际上，难于控制在引物末端仅有一个核苷酸差异 的特异性扩增。 

对于通过使用DNA芯片的检测，通过PCR法扩增的基因产物通常为双链。因此，出现了互补链成为探针的竞争物的问题，降低了在杂交反应中使用探针的杂交效率和检测灵敏性。因此，例如，采用了分解或分离互补链的方法，使得靶基因产物成为单链。但是，这些方法仍有问题，如由于使用酶和磁珠产生的较高的成本和复杂的操作，需要替代这些常规方法的新方法。 

发明公开 

本发明的一个目的是：当应用允许简便且快速地检测核酸的LAMP法的原理时，提供用于检测存在于LAMP扩增产物中的HPV核苷酸序列的核酸引物，以及使用所述核酸引物的HPV检测方法。 

本发明应用了不同于PCR法的方法即LAMP法来鉴定HPV基因型。 

因此，可能易于鉴定基因型。但是，LAMP产物具有复杂的高级结构，在杂交中使用结合有探针的支持物引起物理阻碍，这接下来导致降低杂交效率(参见如JP-A 2005-095043(KOKAI))。因此，在本发明中，如此设计引物，使得衍生自人乳头瘤病毒的靶序列位于LAMP产物的单链环区，这与现有技术不同。 

根据本发明的一个方面，提供了用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物，所述核酸引物选自以下的(a)-(f)：(a)核酸引物，其在同一链上含有选自表1中所示第一序列组的序列的互补序列和选自表2中所示第二序列组的序列；(b)核酸引物，其在同一链上含有选自第一序列组的序列的互补序列和选自表3中所示第三序列组的序列；(c)核酸引物，其在同一链上含有选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列；(d)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交；(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和(f)核酸 引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。 

根据本发明的另一方面，提供了检测人乳头瘤病毒并鉴定其基因型的方法，包括在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤和在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤，其中所述多条引物包括选自上述核酸引物中的至少一条引物。