[发明专利]重组非糖基化人促红细胞生成素及其聚乙二醇修饰化产物的生产方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及非糖基化人促红细胞生成素的高效表达与纯化方法，以及非糖基化人促红细胞生成素的聚乙二醇修饰化的方法。

背景技术

人促红细胞生成素（hEPO）是人调节红细胞生成的主要调控因子。主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化，抑制凋亡以调控红细胞的生成。临床上主要用于增加红血球的数目，用于慢性肾功能衰竭导致的贫血、艾滋病患者贫血、再生障碍性贫血、类风湿关节炎患者贫血、骨髓增生异常综合症患者贫血、镰刀型红细胞性贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血、组织断离、早产儿等多个方面。

在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，得率非常低，且极不稳定(EPO单体半衰期仅1个多小时)，理化和生物性质难以测定，无法大规模应用。利用基因工程技术手段生产的重组人红细胞生成素，可克服这一弊端。rhEPO已经在真核表达系统中国仓鼠卵巢细胞CHO系统中获得表达，但生产成本高、产量低。在大肠杆菌中表达的促红细胞生成素为非糖基化蛋白(rh-ngEPO)，常形成不可溶、无生物活性的包涵体，即使复性在体内也没有活性。此外，缺乏特异性纯化方法，也限制了rhEPO的规模化制备。

SUMO（small ubiquitin-related modifier，小泛素相关修饰因子）融合蛋白表达系统是近年发展的一种新型蛋白表达系统，与其它蛋白表达系统相比，具有以下几点优势：1）SUMO不仅可以提高蛋白质在宿主菌中的表达量，而且能够大大增加蛋白的可溶性；2）准确无误地切除融合标签。由于融合标签会影响重组蛋白的结构和功能，所以融合蛋白必须切除融合标签，通常采用化学或酶学方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多问题，产率低、蛋白沉淀、酶切条件复杂、蛋白酶昂贵等，此外还经常产生非预期的N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶识别SUMO标签的三级结构，因而能准确地切除，不会产生延伸的N-端，而且酶切条件(pH、温度和离子强度)很宽松。但SUMO表达系统是否能用于EPO的表达尚未见报道。

聚乙二醇（PEG）修饰，或称PEG化(PEGylation)，是二十世纪70年代后期逐渐发展起来的一项热门技术，是目前对蛋白质进行化学修饰最重要的技术之一，是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。用PEG修饰蛋白质和多肽药物可大大增加蛋白质和多肽药物的抗蛋白水解酶的降解作用。对蛋白质类药物，由于PEG修饰后，其在体内的循环半衰期显著增长，PEG修饰后，蛋白质药物在体内的药效是增大的。但是，与PEG偶合后的蛋白质和多肽，其空间构象，空间位阻，静电结合性，疏水性等理化性质都会发生变化，与受体连接的亲和力经常因这些理化性质的变化而降低，从而导致聚乙二醇修饰后蛋白质和多肽药物的体外药效降低。

由此可见，蛋白质药物在生物体内易被蛋白酶降解，而经过PEG修饰化的蛋白质药物可以延长其半衰期，但其体外药效一般会降低。因此，如何延长rhEPO蛋白在血浆中的半衰期，同时提高rhEPO蛋白的药物活性，需要系统的研究。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种人促红细胞生成素的生产方法。

本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇修饰化人促红细胞生成素的制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

1、一种融合基因，其编码SUMO-rh-ngEPO融合蛋白。

优选的，所述的融合基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2、含有上述融合基因的表达载体。

3、重组非糖基化人促红细胞生成素（ngEPO）的生产方法，包括如下步骤：

1）将权利要求3所述的表达载体转入宿主菌中，诱导表达SUMO-rh-ngEPO融合蛋白；

2）分离纯化SUMO-rh-ngEPO蛋白，切除SUMO部分，纯化rh-ngEPO蛋白。

4、由3的方法所得到的重组rh-ngEPO蛋白。

5、一种聚乙二醇修饰化非糖基化人促红细胞生成素的制备方法，包括如下步骤：

1）将4所述的rh-ngEPO蛋白与单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-ALD）在3~5℃反应20~28小时，加甘氨酸终止反应；

2）分离纯化得到聚乙二醇修饰的人促红细胞生成素（PEG-rh-ngEPO）。

优选的，步骤1）是在pH 6.0，50 mmol/ L 的磷酸盐缓冲液中进行，所述rh-ngEPO蛋白的浓度为4.5~5.5mg/mL。