[发明专利]重组人硫氧还蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组人硫氧还蛋白的制备方法，具体涉及从原核表达重组人硫氧还蛋白，重组人硫氧还蛋白的纯化及鉴定，构建重组人硫氧还蛋白菌种库、测定种子库的传代稳定性，鉴定重组人硫氧还蛋白的体外生物活性等。

背景技术

硫氧还蛋白(Trx)是分子量约为12kDa的小分子蛋白质，它的氨基酸序列中含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基，该结构位于保守序列：Cys-Gly-Pro-Cys中，为其活性中心。氧化条件下，Cys32和Cys35之间形成二硫键(Trx-S2)，该二硫键能被TrxR通过NADPH供氢还原，还原型Trx(Trx-(SH)2)含有巯基。Trx就是通过二硫键和巯基的互换来实现其氧化还原调节功能的。研究发现Trx广泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳动物中，结构高度保守，人类Trx有105个氨基酸组成。哺乳动物细胞中的Trx在活性中心以外还存在另外3个半胱氨酸残基，可以通过后修饰改变Trx的活性。

人的Trx可分为胞浆型(Trx1)和线粒体型(Trx2)两种亚型。Trx系统，包括Trx、Trx还原酶(TrxR)、还原型辅酶II(NADPH)和Trx过氧化物酶(TrxP)，是一个控制细胞还原/氧化状态和细胞增殖/生存的广泛表达的氧化还原酶系统。Trx在TrxR的作用下可以从氧化型转变为还原型，还原型的Trx可以催化许多含有二硫键蛋白质的还原反应。TrxP可以在还原型Trx的参与下将过氧化氢还原为H₂O。研究发现，Trx除了基本的氧化还原调节功能，还有抗炎、抗凋亡等许多其他生物学活性，因而其与人类疾病的关系日益受到人们的重视。

人体内的Trx是一类防御蛋白，能对多种应激状况做出响应，对细胞进行保护。除了其抗氧化效应，Trx具有抗凋亡和抗炎作用，并且抑制白细胞趋化和趋化因子的表达。已证明在动物模型中，在心血管疾病中扮演着重要角色，是维持心血管稳态的关键调节分子。动物体内注射重组人Trx或者Trx在动物体内的过表达都可以有效地发挥抗氧化和抗炎作用。可以通过减少氧化/硝化应激、抑制心肌细胞凋亡来减弱心肌缺血/再灌注损伤，改善心脏功能，减少心梗面积，从而发挥其心脏保护作用。

并且Trx溶解性好，作为其它蛋白的融合表达标签，可以有效促进蛋白的可溶性表达。Trx有较好的热稳定性，在4℃可保存一个月以上，可以短时间耐受80℃的温度。Trx在哺乳动物体内的半衰期并不相同，在小鼠体内是1小时，大鼠是2小时，猴子是8小时，随尿液排出体外。

虽然硫氧还蛋白有着广泛的应用前景，但目前用于实验室及临床试验的Trx主要有两大类，其中主要以从动物组织中提取的多见，但从动物组织中提取的Trx产量少、纯度低、免疫源性强、价格昂贵。还有少数是采用基因工程重组的，但这些基因工程重组的Trx大都是带有标签的，这种带有标签的Trx无法应用与人体，只有少数是不带标签的，但大多仅限于实验室规模，工艺可行度低、难以扩大生产，无法满足成药性评价这些都使Trx应用受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种人硫氧还蛋白的制备方法，本发明的制备方法步骤简单，快速可靠，成本低，仅仅使用了两步离子交换层析就完成了纯化过程，且纯度达到95％以上。此方法制备的人硫氧还蛋白具有生物学活性，可以和鼠抗人硫氧还蛋白抗血清特异性结合，还可使胰岛素二硫键还原，其活性和标准品无差别。

“重组人硫氧还蛋白”(rhTrx)的DNA序列如SEQ ID No：1所示。

本发明的重组人硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，该制备方法包含以下步骤：

1)诱导培养含有重组人硫氧还蛋白的重组菌，离心获得菌体；2)超声波裂菌，破碎细胞，离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清上样于阴离子交换层析柱，收集目的蛋白所在洗脱峰，得到一次纯化产物；4)将得到的一次纯化产物上样于阳离子交换层析柱，收集目的蛋白所在洗脱峰，得到重组人硫氧还蛋白。最终获得纯度达95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％的目的蛋白质。

步骤1)中，当培养至OD600nm达到7-8时，加入终浓度为1mM的IPTG作为诱导剂，所述菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明所述人硫氧还蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

步骤2)中，加入裂菌缓冲液进行裂菌，菌体和裂菌缓冲液的比例为1g菌体加10ml裂菌缓冲液，所述裂菌缓冲液为STE裂菌缓冲液，该裂菌缓冲液由100mM NaCl、1mMEDTA、pH 8.0的50mM Tris-HCl组成。