[发明专利]一种基于Figla基因的超表达促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法

权利要求书

1.一种Figla基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，包括SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因，在Figla基因的下游连接荧光报告基因。

3.如权利要求2所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

4.如权利要求3所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的荧光标记基因为DsRed，抗生素筛选基因为neor。

5.如权利要求2所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的基于Figla基因序列构建的表达载体为pDsRed1-N1-Figla表达载体，通过Ecor I和Bgl II酶切位点将Figla基因克隆到pDsRed1-N1表达载体中。

6.Figla基因被标记后转染多能性干细胞以促进多能性干细胞向雌性生殖细胞分化或转分化的应用。

7.一种通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因序列，并将Figla基因序列通过Ecor I和Bgl II酶切位点克隆到pDsRed1-N1表达载体，得到pDsRed1-N1-Figla表达载体；

2)将pDsRed1-N1-Figla表达载体转染到细胞中；转染后用以下诱导液进行诱导，诱导液为：H-DMEM培养基+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+15％体积浓度的FBS；

3)诱导后，通过免疫荧光染色和RT-PCR进行生殖特异性基因表达的检测；筛选已分化的雌性生殖细胞。

8.如权利要求7所述的通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，所述的细胞包括P19和传代培养的多能性干细胞；

多能性干细胞的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的胎牛血清。

9.如权利要求8所述的通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。