[发明专利]胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建

权利要求书

1.胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：它按如下步序进行：

(1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。

(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。

(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。

(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒pLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67-GDNF)。

(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。

(6)病毒滴度的测定，将pT67-GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并筛选抗性克隆。

(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM-F12培养液培养传代。

(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将pT67-GDNF细胞上清液感染NSCs，并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。

(9)Western印迹鉴定GDNF-NSC_s，抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞GDNF-NSC_s蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。

(10)ELISA测定GDNF-NSC_s的GDNF含量，将GDNF-NSC_s细胞上清液收集，以ELISA法测定GDNF的含量。

(11)转基因干细胞GDNF-NSC_s生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测GDNF的生物活性。

2.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：所述步序(1)质粒转化大肠杆菌，将TG1大肠杆菌接种于LB液体培养基，以制备感受态大肠杆菌。同时将含GDNF的质粒pSK/GDNF和质粒pLNCX2分别加入到感受态细胞悬液中，转至LB平板培养并挑取阳性菌落进行质粒的抽提与纯化。

3.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：所述步序(2)限制性内切酶消化质粒，使用HindIII和NotI分别消化纯化的pSK/GDNF质粒和pLNCX2质粒，琼脂糖凝胶电泳法进行DNA回收。

4.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：所述步序(3)目的基因与载体的连接、转化及克隆鉴定，经过酶切且胶回收的目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在T4 DNA ligase连接酶的作用下，经16℃反应14小时后，转化大肠杆菌。阳性克隆用Hind III和Not I酶切纯化的质粒，命名为pLNCX2-GDNF质粒。其鉴定采用GDNF基因全长序列的测定法，使用的一对引物上游：5’-TGG GAT GTC GTGGCT GTC TG-3’：下游：5’-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。

5.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：所述步序(4)重组逆转录病毒的包装，成纤维细胞pT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15％的胎牛血清(FBS)培养，细胞汇合度达80％时用Lipofectamine^TM2000(脂染明)将质粒pLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67，G418筛选阳性克隆并定名为pT67-GDNF。

6.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：所述步序(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，pT67-GDNF细胞基因组DNA的抽提与纯化，设计Neo基因序列设计的一对引物，上游为：5’-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’；下游为：5’-CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’。进行PCR扩增并行琼脂糖凝胶(1.0％凝胶)电泳观察、拍照。。