[发明专利]胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，特别是一种胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。

技术背景

1988年，Rousselet等发现神经胶质细胞的条件培养液具有神经营养作用，1993年美国华裔科学家Lin等从神经胶质瘤细胞条件培养液中纯化了这种具有神经营养作用的蛋白质，克隆其基因并将之命名为胶质细胞源生神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)。随后的大量研究表明，GDNF不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且对运动神经元、去甲肾上腺素神经元、外周感觉神经元和交感神经元都有很强的促存活作用；而且GDNF对发育中的运动神经元也有良好的营养作用。GDNF对运动神经元的作用在迄今发现的所有神经营养因子中是活性最强的一个，可以促进运动神经元的存活、分化及代谢功能，对胚胎期或出生后损伤的运动神经元都有很强的修复作用。GDNF的这种对运动神经元所具有的修复损伤作用，为运动神经元性疾病(如脊髓损伤)的治疗开辟了新途径。然而，GDNF是一种生物大分子，难以通过血脑屏障，因而很难直接转移到中枢神经系统。此外尽管GDNF在哺乳动物体内分布较广，但其含量甚微，因此我们利用基因工程的方法以期获得高产量的活性因子用于脊髓损伤的治疗。

长期以来，许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗是临床攻克的难题。应用细胞因子直接注射(一次性治疗)或神经组织移植(细胞替换)疗效有限，且一些神经遗传性疾病以及需合适微环境的神经再生的治疗，仅用细胞介导疗法很难达到理想的效果。因此人们想通过基因治疗来解决这些问题。然而体内基因治疗(in vivo)存在某些缺陷，如携带外源基因的载体很难特异性靶向神经细胞或组织区域，而且也不能替换死亡的神经元。间接体内基因疗法(ex vivo)虽已应用于脊髓损伤的移植治疗，但是载体细胞的选择较为困难。作为中枢神经系统基因治疗的载体细胞应当符合下例条件：①易于获取和增殖，包括许多已建株的细胞和胚胎及新生期幼稚细胞；②载体细胞经转基因处理后移植到脊髓内仍能具有成活和分裂能力；③载体细胞在脊髓内不能造成浸润生长，以免局部成为轴突生长的障碍，甚至形成肿瘤；④载体细胞在体内应能长期持续表达所携带的目的基因；⑤免疫原性小；⑥载体细胞能自身分泌某些营养物质如细胞外基质；⑦最为重要的是载体细胞或其衍生的细胞能替换死亡的神经元或能使已脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。

近年研究提示，神经干细胞(neural stem cells，NSC_s)不仅可在体外大量扩增，而且回输到体内可以长期存活、适当整合于中枢神经组织且可分化成神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞能并稳定表达外源基因，因此是一种理想的载体细胞。尽管NSCs可产生一系列神经营养因子如GDNF，BDNF，NGF，NT-3，NT-4/5^[57]，但这些因子表达有限因而作用甚微。因此，GDNF修饰的胚胎NSC_s的构建为神经系统疾病，尤其是脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等疾病提供了新的更好的治疗方法。

发明内容

本发明的目的是构建一种胶质细胞源生神经营养因子基因(GDNF)修饰的胚胎神经干细胞(NSCs)。所构建的GDNF-NSCs对神经元具有明显的促存活作用，对多巴胺神经元具有重要的营养作用，同时仍然保持了NSCs的干细胞特性，且回输体内后长期存活并可分化成稳定表达外源基因的神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞，为许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗提供了新方法。

技术方案

本发明的目的是按如下技术方案实现的。胶质细胞源生的神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：它按如下步序进行：

(1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。

(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。

(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。

(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒pLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67-GDNF)。