[发明专利]一种青蟹眼柄RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于RNA的提取领域，特别涉及一种青蟹眼柄RNA的提取方法。 

背景技术

青蟹为中国及东南亚沿海重要的甲壳类海产品，我国年产量在10万吨以上，居海水蟹之首。然而，其生长及繁殖方面还存在大量相关的科学问题亟需研究，尤其是其眼柄中X-腺窦复合体内特异表达与生长繁殖相关的多肽基因家族，因此青蟹眼柄RNA的提取是研究这些基因家族的首要问题。青蟹的RNA的提取通常采用Trizol试剂进行，然而用普通Trizol试剂盒提取其眼柄处RNA时，在进行沉淀RNA的步骤会析出大量乳白色沉淀，影响提取过程中RNA的正常沉淀，使得最后提取得到的RNA质量、数量不稳定，无法确保得到高质量的RNA，从而使得后续的分子生物学实验难以顺利进行。 

Trizol试剂盒提取RNA过程中主要步骤：1)由于眼柄RNA易被实验环境RNA酶污染，因此眼柄组织制备需要采用整只眼柄在液氮中研磨完成；2)眼柄组织加入RNAiso Plus试剂后静置离心取上清液；3)上清液加入1/5体积氯仿混合静置离心，此时得到三层相：水相，蛋白相，氯仿相，吸取水相，其余弃掉；4)水相中加入等体积异丙醇静置离心沉淀；5)沉淀用乙醇清洗后烘干，溶于少量DEPC水中。其中在步骤3)中的水相中含有在步骤4)中的乳白色沉淀。根据其在水中有较高的溶解度，加入异丙醇后溶解度下降，并且是在蟹眼柄组织中存在，推测可能是眼柄处甲壳内的甲壳素在RNAiso Plus作用下产生的多糖类物质。这类物质在加入异丙醇后溶解度降低，因此以乳白色沉淀形式大量析出，影响RNA提取。 

同时，青蟹眼柄处RNA极易被周围环境中RNA酶分解，在常温中沉淀RNA，即使在通风橱中完成实验。获得的提取物在电泳时依然经常得到高质量的RNA。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种青蟹眼柄RNA的提取方法，该方法消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄RNA质量不能保证的问题。 

本发明的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，包括： 

(1)在液氮中将青蟹标本的眼柄组织研磨成粉末，取部分加入RNAiso Plus试剂后室温静置离心，取上清液； 

(2)在上述上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，混匀，室温静置离心，获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相； 

(3)在上述水相中加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，室温离心、静置；加入等体积的异丙醇， 混匀，-70℃静置、室温离心，弃上清液保留沉淀； 

(4)在上述沉淀中加入乙醇，室温离心，弃上清液保留沉淀；干燥，用DEPC水溶解沉淀，得青蟹眼柄RNA。 

所述步骤(1)中的RNAiso Plus试剂的加入量为600μl。 

所述步骤(3)中的醋酸钾溶液浓度为5mol/L，用醋酸调节pH至6.0。 

所述步骤(4)中的乙醇浓度为75vol％。 

所述步骤(4)中的DEPC水的加入量为20μl。 

高浓度盐溶液可增高多糖类物质的溶解度，避免加入异丙醇后多糖类物质的沉淀影响RNA提取。因此在本发明中，配置5mol/L醋酸钾溶液，并使用醋酸调pH＝6.0作为增溶剂。加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，4℃，5000g离心1分钟并静置5分钟，该步骤能有效阻止加入异丙醇后大量乳白色沉淀的析出，仅析出少量半透明状沉淀。 

在沉淀RNA时，由于-70℃下RNA酶活性远低于常温，为避免在设备中可能存在的微量RNA酶对实验造成的影响，本发明在-70℃冰柜中沉淀。 

通过本发明的改进方案提取的RNA，无论是电泳，紫外线分光光度仪以及逆转录PCR对比的结果，均显示该发明能够从青蟹眼柄中提取质量较好的RNA。 

有益效果

本发明从难以提取的青蟹眼柄组织中提取出RNA，消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄RNA质量不能保证的问题，支持青蟹眼柄X-腺窦复合体中相关多肽基因的研究，同时对其他甲壳类生物眼柄组织提取RNA提供了启示，具有良好的应用前景。 

附图说明

图l为获得的产物在琼脂糖电泳后得到的条带，从左到右分别是：分子量Marker，常规Trizol法获取产物，本发明的方法获取的产物； 

图2为获得产物的DEPC水溶液在紫外线分光光度仪下的检测结果图表，每一种产物分别检测三次，A表示常规Trizol法，B表示本发明的方法；