[发明专利]稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞

说明书

技术领域

本发明属于杂交瘤细胞技术领域，涉及一种稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞。

背景技术

AEG-1又名LYRIC、Metadherin(MTDH)，2002年该基因在HIV、TNF诱导的胎儿星形胶质细胞上调基因中被克隆。人AEG-1为单次跨膜蛋白，分子量64kD，pI为9.3，基因序列中含有12个外显子和11个内含子，染色体定位于8q22。AEG-1表达蛋白由582个富含赖氨酸的氨基酸组成，含有三个核定位肽(NSL)79-91aa、432-451aa、561-580aa，一个跨膜结构域(TMD)51-72aa，一个肺归巢结构域(LHD)381-443aa和一个N-terminal LXXLL motif基序。

AEG-1与肿瘤发生、发展以及预后密切相关。应用细胞系表达分析显示，AEG-1在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、黑色素瘤、胶质瘤及神经细胞瘤中表达明显高于其正常对照组织。应用肝组织标本检测结果显示，9例正常肝组织几乎检测不到AEG-1表达，而109例肝癌组织中仅有7例检测不到表达，其余102例不同分期、不同分级肝癌组织中AEG-1表达水平与其分期和分级呈正相关性。AEG-1过表达还可增强乳腺癌细胞和293T细胞的肺部转移能力，增加乳腺癌细胞与肺的内皮细胞粘附性，抑制AEG-1基因的表达则会逆转肿瘤细胞与内皮细胞的粘附作用进而抑制其转移能力。下调具有高度肺转移能力的LM2乳腺癌细胞系中AEG-1表达，可明显抑制肿瘤细胞肺转移。目前虽然发现了不少癌基因可作为肿瘤生物治疗的靶基因，但临床效果均不理想，有待进一步研发临床效果更好的恶性肿瘤治疗新靶点，而AEG-1基因及其表达产物有望成为一个恶性肿瘤预后评估及靶向治疗新的切入点。

AEG-1参与了多种信号转导通路。①Ha-ras及PI3K/Akt通路：荧光素酶活性分析显示，永生化细胞THV中过表达Ha-ras可使MTDH启动子活性上调4倍。乳腺癌细胞中原癌基因Ha-ras通过激活PI3K/Akt通路，促进转录调控因子c-Myc与MTDH启动子-356/-302区域的E-box元件结合，从而启动AEG-1基因转录。②NF-κB通路：第一个被证实受AEG-1上调的通路是NF-kB通路，在Hela细胞和恶性胶质瘤细胞中，TNF-a可诱导AEG-1表达，后者转位到核内与NF-κB的p65亚单位结合并上调NF-kB基因的表达。③MEK/ERK通路：在进一步对多种肿瘤的研究中发现，MEK/ERK下游的癌基因转录因子AP-1受到AEG-1的激活。抑制MEK/ERK或p38MAPK通路可减弱恶性肿瘤细胞的侵袭能力。恶性肿瘤细胞内信号转导通路的研究虽然取得了巨大的进展，但恶性肿瘤的发生、发展以及预后是一个多因素、多环节、多阶段的复杂演变过程，因此仍需进一步探讨并明确信号转导通路中各分子的作用，为恶性肿瘤的预防、治疗及早期诊断奠定基础。

发明内容

本发明解决的问题在于提供稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，可用于研究AEG-1在恶性肿瘤细胞中的功能以及信号转导通路中的作用，并用于恶性肿瘤的诊断、预后判断和治疗研究。

本发明是通过以下技术方案来实现：

稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C2011117。

所述的稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，所分泌的单克隆抗体能够识别细胞内所表达的AEG-1分子。

所述的细胞为肿瘤细胞。

所述的肿瘤细胞为恶性肿瘤细胞。

所述的恶性肿瘤细胞为宫颈癌细胞或肺癌细胞。

稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：

首先将AEG-1胞外段基因克隆于表达载体pGSTag构建pGSTag-AEG-1载体，将重组表达载体pGSTag-AEG-1转化大肠杆菌，利用IPTG诱导目的蛋白表达，超声裂菌，纯化得到具有抗原性的AEG-1胞外段蛋白；

以具有抗原性的AEG-1胞外段蛋白作为免疫原免疫小鼠，取血清效价大于10⁵的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用50％PEG进行融合，用含有1×HAT和20％小牛血清的RPMI-1640培养，出现融合细胞后收集上清；

以纯化的AEG-1胞外段蛋白包被96孔板，通过ELISA方法进行筛选，保留AEG-1阳性的杂交瘤细胞，在通过有限稀释克隆方法获得稳定分泌抗AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。