[发明专利]一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法

权利要求书

1.一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述的干细胞样本密度分离液分别由1号液、2号液和3号液组成，按照重量百分比计，其各自组份的含量为：

1号液为稀释剂，选自下列水溶液之一：0.1-30％氯化钠注射液和0.1-20％的脑蛋白水解物组成的水溶液、或者0.1-30％的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1-20％的脑蛋白水解物组成的水溶液；

2号液为沉淀剂，选自0.1-30％羟乙基淀粉水溶液或0.1-30％甲基纤维素水溶液；

3号液为分层液，其为密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。

2.根据权利要求1所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述的脑蛋白水解物为选自下列产品之一：国药准字H20052182、国药准字H20003386、国药准字H20003384或国药准字H20003385；

所述的脑蛋白水解物的组分含量为0.3-15％；

所述的水溶液的水为灭菌注射用水。

3.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述1号液的氯化钠注射液组分含量为0.3-12％或磷酸盐缓冲液的pH为7.1-7.4，其中的脑蛋白水解物组分含量为0.8-6％；

所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为0.5-18％或甲基纤维素组分含量为0.2-8％；

所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.01-1.088g/ml。

4.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述1号液的氯化钠注射液组分含量为0.5-2％或磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4，其中的脑蛋白水解物组分含量为1.5-4.5％；

所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为1.5-12％或甲基纤维素组分含量为0.3-5％；

所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.035-1.08g/ml。

5.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述1号液的氯化钠注射液组分含量为0.9％或磷酸盐缓冲液的pH为7.4，其中的脑蛋白水解物组分含量为3％；，

所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为6％或甲基纤维素组分含量为0.5％；

所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.075g/ml。

6.根据权利要求1至5之一的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述的1号液在超滤条件下除菌，2～3号液在100℃-130℃的温度下，灭菌10-50分钟。

7.根据权利要求6所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于：

所述的2～3号液在105℃-120℃的温度下，灭菌15-20分钟。

8.根据权利要求1～7之一的干细胞样本密度分离液分离干细胞的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

(1)将采集、抗凝后的骨髓、脐带血或外周血样品加入到含有1号液稀释剂的大容量培养液瓶中，得到稀释样品；

(2)在步骤(1)的稀释样品中加入2号液沉淀剂混匀，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后得到浓缩样品；

(3)将步骤(2)的浓缩样品铺到3号液上层，然后离心分离，得到干细胞层。

9.根据权利要求8所述的分离干细胞的方法，其特征在于：

所述步骤(1)的骨髓、脐带血或外周血样品的采集、抗凝、稀释均需在无菌条件下完成，其采集、抗凝方法分别为：

骨髓血采集：采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓针采集骨髓，采集骨髓用的针管中先抽取1-1.5ml枸橼酸钠抗凝液，再抽取骨髓与枸橼酸钠抗凝液合计为5ml，依次方法采集，收集采集的骨髓注入无菌瓶中，得到骨髓血预处理样品；

脐带血的采集：在产妇胎盘脱落后，使用单包含枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将其采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分结合，得到脐带血预处理样品；

外周血采集：对被采血者手臂进行消毒，使用含有枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入手臂静脉采集过程中慢慢摇动采血袋，使抗凝液与外周血充分结合，得到外周血预处理样品。

10.根据权利要求9所述的分离干细胞的方法，其特征在于：

(1)在所述步骤(1)中，经采集、抗凝后的骨髓血、脐带血或外周血预处理样品与1号液的体积比为1∶1，得到稀释样品；

(2)在所述的步骤(2)中，稀释样品与2号液的体积比为2∶1，再经过摇匀1-8分钟，放置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟离心1-20分钟，搜集下层细胞液，得到浓缩样品；

(3)将步骤(2)得到浓缩样品用生理盐水稀释后铺在3号液上，以500-4000转/分钟离心1-60分钟，收集存在于整个离心管中间位置的约2-4mm厚的油状干细胞层；

(4)将收集的干细胞层用生理盐水清洗1-5次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即可。