[发明专利]一种脂肪干细胞的获取方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞获取方法，其特征在于采用混合胶原酶对脂肪组织进行消化，所述混合胶原酶由I型胶原酶、II型胶原酶和IV型胶原酶组成。

2.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，所述混合胶原酶的1%(m/v)母液配制方法为：100ml D-hank’s溶液中加入0.5g I型胶原酶、0.25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶。

3.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，使用所述混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0.15~0.2%(m/v)。

4.根据权利要求3的脂肪干细胞获取方法，使用所述混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0.2%(m/v)。

5.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养消化得到的脂肪干细胞。

6.根据权利要求5的脂肪干细胞获取方法，消化得到的脂肪干细胞接种于培养瓶中培养24-48h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。

7.根据权利要求6的脂肪干细胞获取方法，消化得到的脂肪干细胞接种于培养瓶中培养24h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。

8.根据权利要求1-7中任一项的脂肪干细胞获取方法，所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞。

9.根据权利要求8的脂肪干细胞获取方法，包括：

（1）配制1%(m/v)混合胶原酶母液：100ml D-hank’s溶液中加入0.5g I型胶原酶、0.25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶；

（2）获取和分离人脂肪组织：取人脂肪组织，用pH 值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；

（3）胶原酶消化：加入与所取脂肪组织等体积的0.4%(m/v)混合胶原酶消化，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪；

（4）组织块过滤：将底层细胞用pH值为 7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；

（5）培养人脂肪干细胞：将获得的干细胞按2×10⁴/cm²接种于培养瓶，加入10mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，置于37oC、CO₂含量为5%的培养箱中培养；

（6）换液：培养24h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37°C孵箱中培养；继续培养24h后再次换新鲜培养液，将培养瓶放入37°C孵箱中培养；

（7）传代：待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化，并按1：3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；待细胞传至P2代冻存；

（8）检测：细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准。