[发明专利]一种脂肪干细胞的获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪干细胞的获取方法。

背景技术

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现脂肪干细胞在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能，移植同种异基因ADSCs 将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成为目前研究的新热点，不论在再生医学还是基因治疗方面都具有重大的应用潜力。

为了便于人们有效储存和使用脂肪干细胞资源，目前我公司建立了脂肪干细胞库，并取得了“人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法”的国家专利（专利号：ZL201010120944.4）。

目前脂肪干细胞基本的分离方法是将脂肪组织通过胶原酶I消化孵育1h，消化产物滤网过滤去除未消化组织块，离心后用DMEM完全培养液重悬细胞，最后接种到细胞培养瓶中培养，4-5天后换新鲜培养液，待细胞长满后消化传代。

我们在细胞提取培养的过程中发现，传统的细胞分离方法存在一些问题，比如I型胶原酶消化细胞不够彻底，会有很多未消化的组织块存在；将细胞接种至培养瓶中培养时，P0代和P1代培养的细胞中也有较多的组织块和大量杂细胞，导致P2~P3代冻存时细胞纯度不够。

为克服上述技术的不足，我们在实际操作中改进和优化了脂肪干细胞的分离方法，使得组织消化的更彻底，培养过程中纯度更高，从而保证了更为优质的种子细胞来源。

发明内容

本发明的目的在于克服以上分离提取技术的不足，而提供的一种脂肪干细胞的获取方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。

本发明提供了一种脂肪干细胞的获取方法，其采用混合胶原酶对脂肪组织进行消化，所述混合胶原酶由I型胶原酶、II型胶原酶和IV型胶原酶组成。

本发明的混合胶原酶的1%(m/v)母液配制方法为：100ml D-hank’s溶液中加入0.5g I型胶原酶、0.25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶。使用混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0.15~0.2%(m/v)。

消化得到的脂肪干细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养。脂肪干细胞接种于培养瓶中培养24-48h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。

优选地，所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的脂肪干细胞获取方法包括下列步骤：

（1）配制混合胶原酶：对原有胶原酶进行优化，在采用I型胶原酶的基础上按比例加入了II型胶原酶和IV型胶原酶，使得组织消化更为彻底；

1%混合胶原酶配制方法：100ml D-hank’s溶液中加入0.5g I型胶原酶、0.25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶。

（2）获取和分离人脂肪组织：取人脂肪组织，用pH 值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液。

（3）胶原酶消化：加入与所取脂肪组织等体积的0.3~0.4％(m/v)混合胶原酶D-Hank’s缓冲液消化（混合胶原酶终浓度为0.15~0.2%(m/v)）。

（4）组织块过滤：将底层细胞用pH值为 7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞。

（5）培养人脂肪干细胞：将获得的干细胞接种于培养瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37oC、CO₂含量为5%的培养箱中培养。

（6）换液：培养24h-48h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜高糖DMEM完全培养液，弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37°C孵箱中培养；

继续培养24h后再次换新鲜培养液，将培养瓶放入37°C孵箱中培养。

（7） 传代：待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；待细胞传至P2代冻存。