[发明专利]用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物组

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护领域，提供了利用常温扩增技术对柑桔溃疡病菌的检测，适用于口岸检验检疫等机构应用。

背景技术

柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al.）是柑桔生产上的重要病害，被多个国家列入重大检疫性病害。柑桔溃疡病菌在我国华南沿海、华中和西南的14个省（市）均有发生，对柑桔生产和贸易造成了重大影响。在贵州省榕江县，该病害是柑桔上的主要病害之一，全县发生面积2035 hm²，占全县总面积的94%。很多果园由于受到该病危害变成废园，每年因该病危害造成的产量损失达9万吨，经济损失18000万元。近年来，位居世界柑桔产量第一和第三德巴西和美国也正面临柑桔溃疡病、柑桔黄龙病的威胁，其柑桔产业大幅度萎缩。

柑桔溃疡病传统的检测技术和方法主要包括常规检测方法、酶联免疫吸附检测和普通PCR方法，但这些检测方法均有其不足之处。常规检测法能够检测活的病菌，但需要进行病原物的分离培养、纯化和一系列的生理生化反应及致病性测定，费时费力，难以满足植物检疫“快速、准确”的基本要求；酶联免疫检测中，虽然多克隆抗血清采用近缘细菌菌悬液交叉吸收，提高了特异性，但对于表面污染杂菌和杂质较多的柑桔样品，酶联免疫检测的灵敏度达不到要求，PCR方法虽然特异性高，检测周期短，但其昂贵的仪器设备和较高的假阳性率，也限制了其推广。

本发明应用LAMP引物将恒温扩增技术应用于柑桔溃疡病菌的快速检测，特异性、灵敏度比普通变温PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物组，第二目的是提供了一种利用该引物组检测柑桔溃疡病菌的检测方法。

一种用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物组包括一对外引物，其DNA序列为：SEQ ID NO1：5’-CACGCCATCTGCCAGTTC-3’

SEQ ID NO2；5’-GCGCAGAACGCTATCACTG-3’

和一对内引物，其DNA序列为：

SEQ ID NO3：5’-TAGCCGCCACGACTTGGTTGGGGAAATAGCGCTCGGTG-3’

SEQ ID NO4：5’-ATGCGGTCGTAGATATCCCGGAGCTCTACGACGGTCAACG-3’。

2、一种利用上述引物组检测柑桔溃疡病菌的方法，包括如下步骤：

1）待测样品中DNA 模板的提取：用市售的DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待测样品中DNA。

2）LAMP扩增体系：10μmol/mL SEQ ID NO1、10μmol/mL SEQ ID NO2 、10μmol/mL SEQ ID NO3和10μmol/mL SEQ ID NO4各1μL；2*reaction mix 12.5μL；Bst DNA聚合酶1μL；步骤1）中获得的DNA 模板2μL；灭菌去离子水5.5μL。

3）LAMP扩增条件：将配制好反应体系的PCR管于68℃水浴锅中恒温反应60min；然后80℃，5min终止反应。

4）检测结果：电泳步骤3）中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔溃疡病菌；若为产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔溃疡病菌。

与现有技术相比，本发明的进步在于：检测时间短，效率高；检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的PCR仪，降低了设备投入，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。

附图说明

图1为LAMP引物组恒温扩增结果图；