[发明专利]一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及其用法，专用于兰花胶孢炭疽菌的快速分子检测，同时可用于田间兰花胶孢炭疽菌的早期诊断和病菌的监测与鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术    

兰花是福建省出口创汇的主要花卉产品之一，给种植户带来了巨大收益。福建的建兰（Cymbidium ensifolium）是国兰之祖，与墨兰（Cymbidium sinense），寒兰（ Cymbidium kanran），春兰 （Gymbidium goeringii ），蕙兰（Cymbidium faberi）属兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年生单子叶草本植物，是珍贵的园林观赏植物。在我国民间有着悠久的栽培历史，因其品种多，价格高，且花期较长可多次开花，近年来，种植面积逐步扩大。

据报道，兰花炭疽病是由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的，是生产中的最主要病害。一旦受炭疽病菌侵染后，在叶片或花瓣上出现大小不等的斑点，甚至造成植株不开花，大大降低或失去观赏或商品价值，严重时植株枯死，给生产造成极大的威胁。目前，国内学者对兰花胶孢炭疽菌研究涉及的较少，特别是病菌的分子检测方面。

兰花炭疽病可危害叶片、花瓣、根，不但造成当年生产减产和品质降低，同时也是次年的初侵染来源，其中潜存于植株和土壤中的炭疽病菌是来年炭疽病发生的最主要的初侵染源。病菌主要以菌丝体在病叶、病残体和枯萎的叶基苞片上越冬，分生孢子经越冬，其萌发率大为降低。次年春末、夏初天气潮湿多雨，病菌开始侵染，有伤口和急风暴雨更易感染。病菌可借助昆虫传播和风雨传播而侵染附近植株的叶片，进而使地上部表现症状，形成发病中心，致该病由点到面，迅速蔓延扩大。该病的发生和流行受品种和气象条件的影响较大，其中又以气象条件为主。在适宜的温、湿度条件下，炭疽病菌产生的孢子能迅速繁殖，多次再侵染，很快引致流行。老叶一般于4月份开始发病，新叶则从7-8月份开始发病，高温多雨季节发病严重。如果整株受害严重，幼芽刚萌发时亦受侵染发病。若兰圃中花盆放置过密，杂草多，叶片相互交错，相对湿度过高，病菌易再次侵染。当年不换盆、分盆，盆土粘重板结，透气性差，排水不良，会使病害加重。因此建立兰花胶孢炭疽病原菌分子检测方法，对早期发病植株进行胶孢炭疽菌快速检测，进而监测炭疽病菌的发生情况，对防止该病从发病区向未发病区扩散蔓延以及兰花胶孢炭疽菌早期预测预报和有效防治策略的制定都具有重要的理论和实际意义。

兰花胶孢炭疽菌具有很强的传染性，一旦扩散蔓延则难以控制。目前对兰花胶孢炭疽菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，但该病在按常规方法分离的过程中，由于胶孢炭疽菌生长速度稍慢，经常被包括腐霉在内的其它杂菌所掩盖，给该菌的成功分离和病害的准确诊断造成很大困难。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率和灵敏度均较低，难以满足对兰花炭疽病诊断的实际需要，很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的兰花胶孢炭疽菌快速检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引入该领域，其中PCR技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的研究。核糖体转录间隔区是20世纪90年代发展起来的全新的分子标记。利用核糖体rDNA序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物进行PCR扩增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了广泛的应用。随着炭疽病菌不同种ITS序列数据的积累，以该区域为靶标序列设计特异引物用于炭疽病菌的检测已有成功报道，随着PCR技术的不断改进，后来发展起来的巢式PCR在植物病原菌的检测方面已得到了广泛应用。巢式PCR的灵敏度比常规PCR提高100-10000倍，在植物病害的症状还未显现出来之前，就能对植物体内病原菌进行准确快速的检测，这对制订病害防治最佳时期至关重要。

发明内容

针对现有技术中兰花胶孢炭疽菌的生物学检测方法所需周期长、兰花胶孢炭疽菌还没有系统的分子检测方法的现状，本发明提供了一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物以及兰花胶孢炭疽菌的快速检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物，引物序列为：

上游引物P1: 5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’