[发明专利]对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及对虾传染性肌肉坏死病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。

背景技术

传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染病，2004年美国亚利桑纳大学Lightner D V博士研究发现该病由一种新的病毒引起并将之定名为传染性肌肉坏死病毒（Infectious myonecrosis virus,简称IMNV）。这种新型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南美白对虾，主要是感染60-80天的幼虾。该病毒能造成染病对虾全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70%。该病毒目前已传入亚洲，正威胁着中国的南美白对虾养殖。

Andrade T P D等2007年建立了IMNV的荧光定量PCR检测方法，最低可检测到10拷贝的IMNV，此检测方法灵敏度有待进一步提高。因荧光定量PCR检测方法是进行对虾病毒定量及早期预防的重要有效手段，所以建立高灵敏度的荧光定量PCR检测方法，以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。

发明内容

本发明的目的在于解决现有荧光定量PCR检测方法中存在的灵敏度不高的问题，提供对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，同时还提供了利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏、特异，便于操作。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括盒体1，盒体1内设有管孔支架5，其特殊之处在于管孔支架5上摆放有以下管件：

（1）、荧光定量PCR 反应液管6，内装2×荧光定量PCR buffer、对虾传染性肌肉坏死病毒正反引物及荧光标记的TaqMan探针的混合液；

正向引物序列：5’- GATGG CAGCA CGTCA AAATG -3’ ；

反向引物序列：5’- CAGCT GTTCC TGGGA CTTCC T -3’ ；

TaqMan探针序列：5’-CTATT TCCTC CACTA ATTCA GAGC-3’，探针序列的5’端用FAM 标记，3’端用TAMRA标记；

（2）、去离子水管3，内装无菌去离子水；

（3）、阴性对照管4，内装SPF（无特定病原体）对虾核酸；

（4）、标准品管2，分别内装传染性肌肉坏死病毒10⁷,10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10,1拷贝cDNA阳性克隆。

对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测方法如下：

（1）荧光定量PCR反应体系：