[发明专利]一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒，其特征在于：所述肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。

2.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒用于肝癌衍生生长因子HDGF的检测。

3.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒的检测成分为患者血液或者血浆成分。

4.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒，其特征在于，所述用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体是通过下述方法制备的：

a)构建所述肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；

b)表达所述HDGF蛋白原核细胞并纯化所述HDGF蛋白；

c)产生所述鼠抗HDGF单克隆抗体并纯化；

d)用镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物标记所述二抗。

5.如权利要求4所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒，其特征在于，其中步骤d)采用缓冲液稀释所述鼠抗HDGF单克隆抗体并涂布于固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用所述稀释液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。

6.一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体；

b)表达HDGF蛋白原核细胞，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签，得到HDGF蛋白；

c)产生抗HDGF抗体并纯化，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体，收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体；

d)制备时间分辨荧光试剂盒，在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗。

7.如权利要求6所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中步骤d)将用含NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，2～6℃孵育20h以上，将所述一抗固定到所述固相上。用洗涤缓冲液洗涤涂布了所述一抗的所述固相表面。洗涤后将所述固相保存于-20℃，直至需要进行测定之前。预先用所述稀释缓冲液对血液样本进行稀释。涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次，接着用所述缓冲液稀释的所述鼠单克隆抗体涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用所述稀释液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。将所述含镧族元素Eu的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定。测定条件为延迟时间约为0.2～0.3ms，窗口时间约为0.2～0.6ms，闪烁速度为0.5～1.5ms，激发波长为337.1nm测定波长为615nm。

8.如权利要求6所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷Tris和HCL构成的弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，优选pH为7.5～8.0，优选浓度为0.025～0.075M。

9.如权利要求6所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述稀释缓冲液还包括牛血清白蛋白BSA和NaCL，其中，所述BSA优选的浓度为0.15％～0.25％，所述NaCL的优选浓度为0.6％～1.2％。所述稀释缓冲液的优选稀释倍数，即体液样本与缓冲液比例为1∶5～1∶15。

10.如权利要求6所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的洗涤缓冲液为由Tris和HCL构成弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，含有非离子表面活化剂，表达性为聚氧乙烯山梨糖醇酐酸酯。