[发明专利]一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测用的试剂盒，尤其涉及一种用于肝癌衍生生长因子HDGF检测的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝癌衍生生长因子HDGF具有促进细胞增殖、分化，组织器官生长发育，损伤后组织修复等功能，参与体内多种生理病理过程。HDGF能促进胎肝细胞增殖，参与胎肝发育过程中肝细胞生长发育调控。在大鼠颈动脉气囊扩张损伤模型中，损伤后的动脉新生内膜及肌层HDGF表达明显增高，HDGF参与血管损伤后新生内膜形成中血管平滑肌细胞的增殖与迁移反应。

我们研究胃上皮细胞癌HDGF表达时发现，HDGF核标记指数HDGF-LI在胃癌前病变，如肠上皮化生和不典型增生，发展过程中逐渐增加，如肠上皮化生和不典型增生。胃癌早期继续增加，在进展期胃癌表达水平更高，提示HDGF参与胃癌的形成。胃癌UICC I期患者HDGF-LI低于UICC II、III、IV期患者，无淋巴转移N0患者HDGF-LI低于淋巴结转移N1、N2、N3患者，浸润黏膜及粘膜下层肿瘤相对于侵袭浆膜层肿瘤HDGF-LI低，提示HDGF表达水平与胃癌分期、胃癌淋巴结转移及侵袭深度相关。HDGF与肿瘤发生、发展有关，在肿瘤组织中表达增加，HDGF与肿瘤患者预后相关，有望成为肿瘤诊断新的分子标志物及潜在治疗靶点。

HDGF现有检测方法主要有免疫组化和ELISA法，但是免疫组化是半定量的蛋白检测方法，且检测过程繁琐；而ELISA法的检测灵敏度和重复性均较差。

有鉴于此，制备一种检测过程简单，灵敏度高、重复性好的肝癌衍生生长因子检测试剂盒成为提高HDGF检测质量和效率的一项重要研究课题。

发明内容

本发明的目的是针对现有的免疫组化和ELISA法检测过程繁琐，灵敏度不高，重复性较差的问题，提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法。

根据本发明，一方面提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒，包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。

优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒用于肝癌衍生生长因子HDGF的检测；

优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的检测成分为患者血液或者血浆成分；

优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒中用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体是通过下述方法制备的：

a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；

b)表达HDGF蛋白原核细胞并纯化HDGF蛋白；

c)产生鼠抗HDGF单克隆抗体并纯化；

d)用镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物标记二抗；

优选地，步骤d)采用缓冲液稀释鼠抗HDGF单克隆抗体并涂布于固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用稀释液稀释络合的结合物后涂布于固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次；

本发明的另一方面，提供了一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体；

b)表达HDGF蛋白原核细胞，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签，得到HDGF蛋白；

c)产生抗HDGF抗体并纯化，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体，收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体；

d)制备时间分辨荧光试剂盒，在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗。