[发明专利]一组用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测的引物探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明针对结核分枝杆菌(M.Tuberculosis，MTB)IS6110序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测，属于生物技术领域。 

背景技术

TB是由MTB感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病。MTB可以在人体内潜伏感染长达数年乃至终生，全球人口的三分之一(约20亿)被认为感染了潜伏态的TB，中国人群中约44.6％有潜伏TB感染，而且其中超过10％的人在他们的一生中会发展成活动性疾病。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2010年全球TB控制报告，2009年全球因TB死亡约170万，新增TB病人约940万。这些病人大多集中在诊断治疗技术落后、缺乏资金支持的发展中国家。我国的TB病人数居世界第二位，仅次于印度，每年发病发病人数约130万，成为我国急需关注的公共卫生问题和社会问题。 

体内潜伏MTB被激活以及肺结核(Pulmonary Tuberculosis，PTB)病源传染是导致大多数PTB发病的主要原因。提高检测阳性率和及早诊断治疗MTB感染者是控制TB传播的最直接有效的手段之一。及早发现活动性PTB病人，及时采取隔离和治疗措施，则能显著降低发病率、死亡率和传染率。目前常见TB诊断方法有：结核菌菌数皮试试验(PPD)、计算机断层扫描(CT)、痰涂片法和痰培养法。PPD因为特异性差，容易出现假阳性结果而不能作为诊断依据；CT灵敏度低，只有在有出现肺部病灶时才能被诊断，达不到早期诊断效果，而且肺结核与其他肺部疾病难以区分，且不能作为确诊诊断；痰涂片法简单快速，但灵敏度不高，不能区分MTB和其他抗酸分支杆菌；培养法被誉为TB诊断“金标准”，可以鉴定MTB与其他分支杆菌，但诊断周期长，通常需要4～8周，且灵敏性低，延误病人治疗。 

近十年来兴起的TB分子诊断技术如实时荧光PCR(Real Time PCR，RT PCR)等，提高了TB诊断的灵敏度和特异性。RT PCR利用一对MTB特异性引物和特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq emzyme)、4种脱氧核酸苷酸(dNTP)等成分，用体外热循环扩增法检测MTB基因片段，通过检测荧光强度变化来判断标本中是否存在MTB DNA。RT PCR检测对象为病原体基因保守序列，不受细胞表型和耐药性影响，可提高阳性检出率和结果准确性，而且在数小时内即可报告结果。 

现有的RT PCR虽然能提高TB检测灵敏性和特异性，但其在痰涂片阴性病人(包括菌阴 病人)检测阳性率依然有待提高。目前涂片阴性病人在总TB病人数60％左右，该部分病人因痰液中MTB菌量不高而难以被检测。虽然涂阴病人吐菌量不高，但他们是TB重要传染源之一。据报道，约20％受检查的涂阴病人密切接触者最终被确诊为TB。因此如何提高TB涂阴病人中检测阳性率，是RT PCR亟需解决的问题。 

RT PCR体系中引物和探针的选择和设计是提高RT PCR检测效率的有效办法，本发明针对MTB复合群基因组重复性因子插入序列IS6110设计和筛选出一组用于荧光PCR的高特异性和灵敏度的引物和探针序列及其使用方法。本发明方法采用荧光PCR检测法，应用TaqMan荧光探针原理，加入一对TB复合群的特异性引物和一条特异性荧光双标记探针，两端分别标记一个报告荧光基团(FAM)和一个淬灭荧光基团(Taqman-MGB)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，通过检测荧光信号的增加来判断结果阳性，提示标本含有TB DNA。本发明方法具有以下特点：<i>灵敏度高；<ii>兼容性好；<iii>高通量；<iv>特异性高。由本发明设计的引物探针序列建立的TB实时荧光PCR检测方法能明显提高RT PCR检测效率，通过临床标本检测证实其在涂阴病人标本和血标本检测阳性率高于其他RT PCR检测。此外，本发明可用于对TB药物治疗效果评价、指导用药和病情进展等。 

发明内容

本发明目的在于设计一组高敏感和特异性的引物探针序列，用于结核分枝杆菌荧光PCR检测，进一步提高荧光PCR检测灵敏度。本发明设计的引物探针以及基于该引物探针所建立的荧光PCR能有效提高临床上结核涂阴病人和血标本的检出率。 

作为本发明的核心，所述的一组用于MTB实时荧光PCR检测的核苷酸序列：