[发明专利]沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法

权利要求书

1.沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)选取烟粉虱抗药性CYP6CM1基因和coe1基因为RNAi靶基因；

2)通过Overlap PCR将CYP6CM1基因和coe1基因的部分序列嵌合并以之构建反向重复序列的RNAi载体；

3)RNAi载体通转化目的植物，获得具有防治烟粉虱效果的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)根据烟粉虱CYP6CM1基因和coe1基因序列，分别设计下列两对引物F1/R1和F2/R2；

F1 ATGGCGGCAGCTATTGACA

R1 GTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCA

F2 TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCA

R2 GCCATACTTTTTCAGCAGGCT

2)提取烟粉虱RNA并反转录获得cDNA，以步骤1)引物通过Overlap PCR获得CYP6CM1基因和coe1基因的嵌合基因，嵌合基因序列如SEQ NO.1所示，纯化后与pGEM-T Easy Vector连接，转化大肠杆菌JM109，测序吻合，提取质粒DNA；

3)以步骤2)质粒DNA为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和中间载体Hurricane分别用BamHI和HindIII酶切，酶切片段再进行连接，得到Hurricane-T，

F3 CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG

R3 TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT；

4)以步骤2)质粒DNA为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和Hurricane-T分别以XhoI和SacI酶切，酶切片段再进行连接，得到Hurricane-RNAi，

F4 CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG

R4 CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG；

5)用BamHI和SacI分别酶切植物表达载体pBI121和Hurricane-RNAi，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，获得RNAi载体；

6)农杆菌介导法将RNAi载体转化烟草，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因烟草。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNAi载体含有SEQ ID NO.1所示的部分或全部核苷酸序列。