[发明专利]肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药、生物技术、化学、免疫生物学领域。

背景技术

近年来，国内外文献越来越多地报道了一种新的肿瘤治疗方法——光动力疗法(PDT)。肿瘤光动力疗法是现代肿瘤微创或无创治疗领域的最新进展，于1996年被美国FDA批准应用于临床，并在美国、日本、英国、法国、德国、加拿大等国用于多种肿瘤治疗取得成功。2003年5月中国SFDA批准了这一治疗系统进入临床应用。

光动力疗法是一种正在发展中的治疗恶性肿瘤的新型治疗手段，临床上已用于多种肿瘤的治疗。为了增加光动力疗效，我们选用能与肿瘤细胞特异性结合的单克隆抗体为载药工具，将光敏剂与抗体共价偶联，形成稳定的光敏免疫偶联物，由抗体进行导向，使光敏剂与特定肿瘤细胞进行特异性结合，达到靶向给药的目的，提高治疗的依从性。

光动力治疗是一种很有前景的肿瘤治疗方法，在临床上已经被运用于头颈部肿瘤、食管癌、乳腺癌、基底细胞癌等多种肿瘤的治疗，但是目前的光动力治疗的药物仍存在一些不足，如：光敏剂对肿瘤的选择性差；存在光毒性反应，治疗后病人避光时间长。为了克服这些不足，人们开始进行了光免疫治疗的研究，达到靶向给药的目的。

光免疫治疗是指将光敏剂与单克隆抗体通过化学方法联接，制备出光敏免疫偶联物，旨在选择性的将光敏剂运输到肿瘤部位，使肿瘤部位的光敏剂浓度增高，减少用量，提高疗效，同时，由于皮肤对大分子物质渗透性差，也可以降低光毒性反应，缩短避光时间。1983年加拿大的Mew.D等首先报道了血卟啉与单克隆抗体的交联物对靶细胞具有杀伤作用。在国内，制备血卟啉一抗体偶联物已有先例，刘建源等将血卟啉衍生物与抗CEA单抗制成免疫偶联物，肿瘤细胞特异结合的单抗与光敏剂偶联，使得光敏剂通过单抗的导向作用到达肿瘤组织的剂量增加、滞留时间延长且吸收增加，并且副作用减少。

酞菁及其衍生物以其良好的光热稳定性、强的红外吸收、和较强的光动力效应等优点，成为新一代光敏剂中的佼佼者。本项发明主要利用一种单取代酞菁锌与靶向肿瘤的单克隆抗体制备光敏免疫偶联物，提高光动力治疗的靶向特异性，以增加该光敏剂的选择性，同时也减少它对正常细胞的毒性。

发明内容

本申请提供了一种高活性的酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法及其抗肿瘤应用的技术方法(图1)，所制备的光敏免疫偶联物具有成本低、稳定性好、抗肿瘤活性高等特点。

一、本项发明所用的单克隆抗体是具有如下特征的单克隆抗体：

1)分子量：150-170KDa；2)吸光特性：280nm具有特征吸收峰；3)生物学特性：单克隆抗体，能特异性识别肿瘤细胞表面生长因子受体，并与之发生抗原-抗体反应。4)本项发明所述的单克隆抗体包括曲妥珠单抗(Herceptin)、西妥昔单抗(cetuximab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)等能特异性识别肿瘤细胞表面生长因子受体的单克隆抗体。

二、酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法如下：

1)水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物的制备，以已公开的“一种广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂及其制备方法和用途”(专利申请号：200510107773)所提及的一种新型酞菁类光敏剂，即单羧基取代酞菁锌(ZnPc-COOH)为基础，将单羧基取代酞菁锌与表面带有五聚赖氨酸(5K)的树脂反应，再用水合肼肼解，脱去保护基，形成水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物(ZnPC-CO-5K-NHNH2)。本项发明利用水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物与单克隆抗体共价偶联，目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。

2)抗体氧化：单克隆抗体在PH7.2的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度10mM的高碘酸钠，25℃氧化30min后，加入终浓度10mM的抗坏血酸，将残留的高碘酸钠彻底还原成碘离子，防止残留的高碘酸钠氧化将要偶联的酞菁锌，本发明利用抗坏血酸还原高碘酸钠，这种做法目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。

3)将氧化后的单克隆抗体与ZnPC-CO-5K-NHNH2偶联，取氧化后的单克隆抗体与单羧基酞菁锌酰肼衍生物按摩尔比1∶10，溶于在PH7.2的磷酸盐缓冲液中，混匀，4℃冰箱避光涡旋震荡过夜后，加入还原剂，4℃冰箱，反应4h，形成稳定偶联物。本发明在中性的水溶液中完成抗体与酞菁锌的偶联，最大程度的保存抗体的活性，这种做法目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。