[发明专利]花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞遗传学制片方法，具体是涉及一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法。

背景技术

植物染色体是细胞遗传的物质基础，染色体结构和数目的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源，根尖细胞有丝分裂中期制片为研究植物染色体提供了很好的技术手段。然而植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难平整地分散在载玻片上。为了得到良好的植物根尖细胞有丝分裂中期的染色体制片，最初研究者用盐酸解离软化细胞壁，后来采用酶解去壁低渗的染色体制片方法，该方法能使染色体分散平整，在植物染色体上有着广泛应用。但是，酶解去壁低渗方法在去除细胞壁的过程中，酶解时间、低渗时间不易掌握，且不同植物材料处理时间可能不同，染色体丢失较多；酸解同样存在解离时间不宜控制，不同植物材料处理时间可能不同；此外盐酸对染色体的结构影响较大，若解离时间太短，细胞压不开；解离时间太长，则染色体破坏较为严重，试验效果均不理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种适用性强、步骤简化、易于控制的花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法。

本发明的技术方案：

一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法，包括以下步骤：

（1）预处理：选取长10-15 mm、粗0.8-1.2 mm的新鲜花生根尖，用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理； 

（2）固定：将花生根尖放入卡诺氏固定液中，室温处理12-24h，放入-20℃冰箱中，待用；

（3）醋酸压片：取固定好的花生根尖，用体积浓度为45%的醋酸浸泡30-60秒，待根尖膨胀饱满后，切取分生区根尖0.3-0.6 mm置于载玻片上，滴一滴所述醋酸，盖上盖玻片，调整根尖至盖玻片正中位置，用双面刀片垫起盖玻片一角，用解剖针垂直在盖玻片中央敲击一下，再在盖玻片上根尖四周垂直敲击5-8次，使材料细胞分散，然后将载玻片放在酒精灯的外焰火烤解离软化细胞壁，火烤时间以盖玻片上雾状散开为宜，用滤纸垫在盖玻片上吸去多余醋酸，用拇指垂直向下压盖玻片，然后在相差显微镜下进行观察；

（4）冰冻揭片：将处于有丝分裂中期、染色体平整分散细胞的制片放置于-70~-80℃的超低温冰箱中冰冻12-24h，用双面刀片快速揭开盖玻片，将载玻片放入无水乙醇中脱水12-24h，最后吹干无水乙醇，待用；

（5）染色体染色分带或荧光原位杂交。

所述用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理的时间为3h。

所述卡诺氏固定液的成分为：酒精:冰醋酸的体积比为3:1。

所述处于有丝分裂中期、染色体平整分散的细胞数目为10个以上。

所述染色分带是将吹干无水乙醇的载玻片在1×PBS中浸泡10分钟，同时在995μL DAPI缓冲液中加入5 μL 浓度0.1mg/ml的DAPI母液，混匀，处理完毕后每片加500 μL DAPI染液，染色2分钟，用1×PBS冲洗4-5次，滴加胶液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余的胶液；在荧光显微镜下用450～490 nm激发光波长观察，摄取图象。

所述花生根尖细胞用芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄的根尖细胞来替代。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明选择粗细适中的花生根尖进行压片，得到的制片细胞平整、染色体分散，且居分裂中期的细胞较多。若选择的根尖太粗，细胞壁、表皮组织过厚，则细胞压不平（图1）, 若根尖太细，分生区细胞及中期分裂相太少，制片不理想。

（2）本发明通过敲击盖玻片使分散细胞后，以45%（V/V）的醋酸为介质，用酒精灯火烤，使细胞充分解离软化，然后垂直压片获得平整分散的中期染色体分裂相（图3、图4）。该方法克服了以往采用盐酸解离造成的细胞粘连、染色体不宜散开、染色体形态不理想的缺点（图2），还克服了不同植物间盐酸解离时间不同的问题。

（3）本发明方法简化，不用酶解去除细胞壁，也不用低渗，不用盐酸解离，而用醋酸做介质直接进行压片，试剂对染色体的影响较小，整个过程易于操作控制，步骤简单，节约试剂和实验时间，能提高制片效率。

（4）本发明的方法不仅适用于花生，也适用于芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄等多种植物根尖细胞有丝分裂中期的制片。实验表明，该方法可以获得良好的染色体制片效果，适用性较强。通过冰冻后揭片，用荧光染料DAPI染色，可显示出染色体的清晰带纹，具有良好的可操作性。

附图说明