[发明专利]基因工程菌、用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及的是一种基因工程菌及其表达制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的生产方法，以及该酶酶学性质的测定和在L-同型半胱氨酸检测试剂盒中的应用，具体为基因工程菌、用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用。

背景技术

同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸-4-巯基丁酸，也称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，参与甲硫氨酸的代谢过程，可被甲基化生产蛋氨酸，或被转硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，并可释放到血液中。它涉及亚甲基四氢叶酸还原酶、胱氨醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶等多种代谢调节酶；也涉及调节酶的多种辅助因子如叶酸、维生素B6和维生素B12。当上述酶基因突变或辅助因子缺乏，会导致甲硫氨酸的代谢产物Hcy的转化受阻，使血浆中Hcy水平升高。目前研究认为，Hcy水平的升高与心、脑血管及周围血管动脉粥样硬化病变有关，并与老年痴呆、肾功能衰竭、流产及糖尿病早亡有关，所以Hcy的体外检测具有重要的临床价值，可用于预测脑血管疾病发生的危险性。

目前检测血浆中Hcy的方法很多，主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)。HPLC法操作复杂、耗时且费用较高；ELISA法操作方便、快捷、重复性好，但是大部分操作仍需手工操作，不适合临床大批量标本同时测定。目前循环酶法测定高半胱氨酸(Hcy)容易自动化，测定时间短，可以在自动生化分析仪上进行，测定灵敏度高。该方法利用的主要技术原理利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)在三乙羧乙基膦(TECP)作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型Hcy，游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)催化反应形成蛋氨酸和S腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)。AdoHcy被AdoHcyase水解成腺苷(Ado)和Hcy，生成物Ado立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的Hcy的浓度与NADH的变化成正比。

AdoHcyase在Hcy的循环酶法检测中具有重要的作用，然而目前现有的AdoHcyase催化AdoHcy水解反应的Km值偏高，生产方法繁琐，导致在试剂盒配方中，所需酶量偏多，试剂盒成本偏高，一定程度上限制了循环酶法在Hcy检测中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种基因工程菌。

该基因工程菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCCNo.5654，保藏日期：2011.12.26，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该工程菌是通过PCR技术从环境基因组文库中筛选获得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)基因，插入到含有T7强启动子的PET28质粒中，化学转化导入大肠杆菌BL21中，获得高效表达AdoHcyase的基因工程菌。

上述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID.No.1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列编码的如SEQ ID.No.2所示的氨基酸序列。

该基因工程菌菌株的典型培养特征为：形态特征：菌落乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。

生理生化特征：具有大肠杆菌的生理生化特性，同时插入了AdoHcyase基因，具有高效表达AdoHcyase特性。

本发明上述的基因工程菌是这样获得的：

(1)用提取试剂盒从环境中直接提取总DNA，并克隆到载体PUC18上，构建环境基因组文库；

(2)根据AdoHcyase基因序列设计引物，两条引物分别为：

上游：5’-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3’

下游：5’-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3’

(3)应用如上所述引物，应用PCR方法从环境基因组DNA文库中大量筛选克隆，扩增获得1.2kb的AdoHcyase基因片段，并通过测序，确定获得的片段具有如SEQ ID.No.1所示核苷酸序列和SEQ ID.No.2所示氨基酸序列；通过BLAST比对，与报道的嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的AdoHcyase基因具有98％的同源性；